[发明专利]一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法

说明书

一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，包括步骤：将蜂王浆溶于抽提缓冲液中，混合均匀，离心取上清，上清加入饱和硫酸铵进行沉淀，离心后取上清，通过滤膜过滤得样品缓冲溶液；通过超滤离心管将样品缓冲溶液置换为pH7.0缓冲液A；将蜂王浆样品上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；以缓冲液A和缓冲液B的混合液对柱子进行梯度洗脱，并从0到100％逐渐提高缓冲液B的比例，依次分离纯化出蜂王浆主蛋白2和3。本发明的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，增加了蜂王浆主蛋白2和3的丰度，提高了蜂王浆主蛋白2和3的产量，重复性好，产量高，可大量生产蜂王浆主蛋白2和3。

技术领域

本发明涉及化学提取、分离，具体涉及一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法。

背景技术

蜂王浆的蛋白组分主要由蜂王浆主蛋白1、2、3组成，蜂王浆主蛋白1、2、3各具有独特的生理功能，均有益于人类健康。传统的纯化蜂王浆主蛋白1、2、3的方法主要有透析、多种层析分离方法叠加组合等，不仅耗时、费力而且成本高、收率低，难以满足生物学研究所需，也不适合规模化生产，其中丰度低是一个很重要的原因。因此，开发一种简单快速的样品处理方法，通过提高样品中蜂王浆主蛋白2和3的丰度提高其相应产量是必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，以克服传统分离方法存在的收率低的缺陷。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，包括步骤：

S1：将蜂王浆溶于pH 7.4的抽提缓冲液中，震荡过夜，低温离心，取上清，将饱和硫酸铵加入上清混合均匀，至硫酸铵终浓度为30％～60％，低温孵育1小时或过夜；

S2：取步骤S1中混合液4℃离心20分钟，取上清，上清以0.2微米孔径的滤膜过滤得样品缓冲溶液；

S3：通过截留分子量为10K的超滤离心管将样品缓冲溶液置换为pH7.0缓冲液A；

S4：将步骤S3制备的蜂王浆样品上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；

S5：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，并从0到100％逐渐提高缓冲液B的比例，依次分离纯化出蜂王浆主蛋白2和3。

作为本发明进一步改进的技术方案，所述步骤S1具体包括：将蜂王浆按照1：5溶于pH 7.4的抽提缓冲液中，震荡过夜，4℃条件下离心20分钟后，取上清，将饱和硫酸铵加入上清混合均匀，至硫酸铵的终浓度为30％～60％，4℃下孵育1小时或者过夜。

作为本发明进一步改进的技术方案，所述硫酸铵的终浓度为50％。

作为本发明进一步改进的技术方案，所述抽提缓冲液的组成为500mM NaCl，8mMNaH₂PO₄，42mM Na₂HPO₄，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN₃，pH7.4。

作为本发明进一步改进的技术方案，所述缓冲液A的组成为22mM NaH₂PO₃，3mMNa₂HPO₃，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN₃，pH7.0。

作为本发明进一步改进的技术方案，所述缓冲液B的组成为2M NaCl，84mMNa₂HPO₄，16mM NaH₂PO₄，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN₃，pH7.5。