[发明专利]一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法

权利要求书

1.一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法，其特征在于所述方法不涉及疾病诊断与治疗，包括以下步骤：

1)筛选引物组合及引物序列；

所述筛选引物组合具体为：

通过全基因组分析，寻找靶毒力基因的特征性基因片段，选择其中不同种气单胞菌高度保守的区域，作为设计引物的靶序列，按照引物设计原则，设计并合成多对引物，再通过大量单重PCR实验，筛选出扩增效率高、特异性强的引物序列，最后，根据多重PCR原理，筛选出一种同时检测气单胞菌1个管家基因和7个毒力基因的多重PCR引物组合，所述多重PCR引物组合包括：管家基因gyrB，气溶素基因Aer，丝氨酸胞外蛋白酶基因ahp，热敏感性胞外蛋白酶基因epr，3个肠毒素基因act、ast、alt和溶血素基因hlyA；并组合成两套四重PCR引物，分别为第1套mPCR引物组合和第2套mPCR引物组合，所述第1套mPCR引物组合包括gyrB、aer、ahpA、epr；所述第2套mPCR引物组合包括act、ast、alt、hlyA；

所述引物序列，具体为：

所述管家基因gyrB引物对的核酸序列为：

gyrB-F：5’-AAGCAGATTGGCGACAGCAC-3’，或者该序列的核酸互补序列；

gyrB-R：5’-CGTTCAGGATCTTGCCCTTG-3’，或者该序列的核酸互补序列；

gyrB引物对扩增靶基因片段大小约为880bp；

所述丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahpA)引物对的核酸序列为：

ahpA-F：5’-TGCCCATCGCTTCAGTTCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；

ahpA-R：5’-GTGCGGCTGAACATGTAGTCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；

ahpA引物对扩增靶基因片段大小约为720bp；

所述热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)引物对的核酸序列为：

epr-F：5’-GATGTCGCTCTTCTGGGTGT-3’，或者该序列的核酸互补序列；

epr-R：5’-CGTTAACCTGACCCTGACCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；

epr引物对扩增靶基因片段大小约为460bp；

所述气溶素基因(aer)引物对的核酸序列为：

aer-F：5’-CTCCAAGATCCCGGTGAAGA-3’，或者该序列的核酸互补序列；

aer-R：5’-TGTCCCACTGGTAGCGAATG-3’，或者该序列的核酸互补序列；

aer引物对扩增靶基因片段大小约为220bp；

所述肠毒素基因(act)引物对的核酸序列为：

act-F：5’-TTCCAGACGGTGACGAAGT-3’，或者该序列的核酸互补序列；

act-R：5’-CAGCCTTGTAGAGCTCGATCT-3’，或者该序列的核酸互补序列；

act引物对扩增靶基因片段大小约为620bp；

所述肠毒素基因(ast)引物对的核酸序列为：

ast-F：5’-GTCAGCGACAGCTTCTTCAT-3’，或者该序列的核酸互补序列；

ast-R：5’-CGTCGTCAAACAGAAAGCC-3’，或者该序列的核酸互补序列；

ast引物对扩增靶基因片段大小为约350bp；

所述肠毒素基因(alt)引物对的核酸序列为：

alt-F：5’-CAAGCTGCCCTACTTCCTCT-3’，或者该序列的核酸互补序列；

alt-R：5’-CCACCGGTATCGAACTTGA-3’，或者该序列的核酸互补序列；

alt引物对扩增靶基因片段大小约为820bp；

所述溶血素基因(hlyA)引物对的核酸序列为：

hlyA-F：5’-ATCAGCGATGCCGAGTGTA-3’，或者该序列的核酸互补序列

hlyA-R：5’-TCCTCGTTGAGCTGGATACC-3’，或者该序列的核酸互补序列

hlyA引物对扩增靶基因片段大小约为220bp；

2)多重PCR反应体系与扩增条件；

所述多重PCR反应体系，具体为：

①多重PCR扩增的反应体系为：

第1套mPCR反应体系：

第2套mPCR反应体系：

10×PCR buffer mixture：150～220mM Tris-HCl，pH 8.0～8.5，150～250Mm KCl，50～150Mm(NH₄)₂SO_4,0～20mM MgCl₂；

dNTPs mixture：dATP、dGTP、dCTP各8～20mM，dTTP和dUTP各5～15mM；

②多重PCR的扩增条件如下：

98℃预变性4min，98℃变性30s，58～60℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～35个循环后，然后再72℃温度延伸7min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存；

3)多重PCR产物检测和结果判读，具体方法为：

①电泳：对步骤2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳检测，1.2％的琼脂糖凝胶，电压为100～140V，电泳30～45min；

②结果判读：

第1套mPCR扩增结果，所述第1套mPCR为检测靶基因为gyrB\ahpA\epr\aer：

若约880bp处出现条带，表明样品中含gyrB基因，属于气单胞菌；

若约720bp处出现条带，表明样品中含有ahpA毒力基因；

若约460bp处出现条带，表明样品中含有epr毒力基因；

若约220bp处出现条带，表明样品中aer含有毒力基因；

若同时在上述不同相应位置出现条带，则表明该样品中含有多个相应的毒力基因；

第2套mPCR扩增结果，所述第2套mPCR为检测靶基因为alt\act\ast\hlyA：

若约820bp处出现条带，表明样品中含有alt毒力基因；

若约620bp处出现条带，表明样品中含有act毒力基因；

若约350bp处出现条带，表明样品中含有ast毒力基因；

若约220bp处出现条带，表明样品中含有hlyA毒力基因；

若同时在上述不同相应位置出现条带，则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。