[发明专利]一种B2m基因改造的免疫缺陷动物的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种能够特异的靶向B2m基因的sgRNA序列、构建免疫缺陷非人动物或其子代的方法及其在生物医药领域的应用。

技术领域

本申请属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术获得免疫缺陷动物模型的方法以及用于特异性靶向B2m基因的sgRNA。

背景技术

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。已有研究表明作为受体鼠，目前普遍使用的免疫缺陷动物排序如下：NOD-Prkdc^scidIL-2rγ^nul小鼠〉NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)〉Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)〉NOD/SCID〉裸鼠，表明NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^nul小鼠是目前最佳的移植受体鼠(Ito R et al.Cell MolImmunol.2012May；9(3):208-14)。

然而NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠仍然存在缺陷，尽管由于该小鼠机体免疫功能严重降低，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化动物模型研发。但在免疫系统重建过程中，由于植入的是异种来源的成熟T细胞，小鼠会随时间推移而产生移植物抗宿主疾病(xenogeneic graft-versus-hostdisease,X-GVHD)，已有研究表明1×10⁶至2×10⁷的人PBMC注入该小鼠体内，通常会在4周产生移植物抗宿主病反应(xenogeneic graft-versus-host disease,X-GVHD)，最终导致NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^nul小鼠在移植后约20-50天内死亡，并存在明显的人T细胞浸润小鼠皮肤、肝、肠、肺和肾脏的表现，这使得该小鼠成为研究X-GVHD的有利模型(Golovina TN etal.J Immunol.2008Aug15；181(4):2855-68；King MA et al.Clin Exp Immunol.2009Jul；157(1):104-18；Niwa Ali et al.PLoS One.2012；7(8):e44219)，但这极大地限制了功能性试验(如，药效研究)所能展开的周期，且对功能性研究的结果可能有影响，如，进行的药效检测可能不准确。另外有研究表明小鼠体内的NK细胞也会影响人PBMC的植入水平。