[发明专利]一种B2m基因改造的免疫缺陷动物的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种构建免疫缺陷非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述动物体内β2微球蛋白不表达或表达的β2微球蛋白不具有功能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，敲除动物体内B2m基因的全部或部分。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，敲除动物体内B2m基因的第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行免疫缺陷非人动物或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的动物为免疫缺陷的；所述的动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，使用靶向B2m基因的sgRNA序列敲除动物体内B2m基因的第1号外显子至第3号外显子的全部或部分，其中，所述sgRNA序列靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-4任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：5-8任一项所示。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备获得sgRNA载体；

2)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至非人动物或其子代受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体雌性非人动物或其子代的输卵管中发育，得到F0代非人动物或其子代；

3)将F0代非人动物或其子代利用PCR技术进行检验，验证细胞中的B2m基因修饰成功，获得免疫缺陷阳性非人动物或其子代；

4)将步骤3)筛选出的阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的免疫缺陷动物；

优选的，所述步骤3)中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型；优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法构建的免疫缺陷非人动物或其子代。

10.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株中不表达β2微球蛋白或表达的β2微球蛋白不具有功能。

11.根据权利要求10所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株中缺失B2m基因的全部或部分；优选的，所述细胞株中缺失B2m基因的第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。

12.一种靶向动物B2m基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在待改变的B2m基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。

13.根据权利要求12所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在非人动物B2m基因的靶位点位于非人动物B2m基因的第1号外显子和/或第3号外显子上。

14.根据权利要求12或13所述的sgRNA序列，其特征在于，sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-4任一项所示，sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：5-8任一项所示；优选的，sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：3所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：7所示。