[发明专利]一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法

说明书

本发明属于胶原蛋白技术领域，尤其涉及一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法。本发明提供了一种非变性胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：a)将胶原蛋白加入孵育液进行孵育，离心，得到不溶物；b)将所述不溶物依次进行酶解、中和、盐析，得到非变性胶原蛋白；其中，所述孵育液选自Tris‑HCl溶液、Bis‑Tris溶液、咪唑缓冲液或胰蛋白酶培养液。实验结果表明，本发明采用孵育液对胶原蛋白进行孵育，可除去变性胶原蛋白，对非变性胶原蛋白进行提取，可提高胶原蛋白产品的活性。

技术领域

本发明属于胶原蛋白技术领域，尤其涉及一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法。

背景技术

蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命，蛋白质是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与，人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。如载体蛋白对维持人体的正常生命活动至关重要，可以在体内运载各种物质；人体细胞里每分钟要进行一百多次生化反应，酶对生化反应具有催化和调节功能，并且酶有促进食物的消化、吸收、利用的作用；球蛋白是一种存在于人体中的血清蛋白，被称为免疫球蛋白，具有免疫作用。

胶原蛋白是一种生物高分子纤维蛋白，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。胶原蛋白主要从动物皮肤或骨骼(如鱼皮/鳞、猪皮/骨、牛皮/骨等)中进行提取得到，再进行水解得到胶原蛋白肽，胶原蛋白肽可溶于冷水，且易被人体吸收利用，具有伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等功效。胶原蛋白有不同的类型，目前为止已经发现了几十种。其中Ⅰ型胶原蛋白主要存在于皮肤血管等结缔组织中；Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织，对消化酶有一定抵抗作用，口服后有可能在小肠经胰蛋白酶作用产生活性片段，刺激胃肠道黏膜免疫系统，从而起到口服诱导免疫耐受的作用，可预防或缓解类风湿性关节炎病症；Ⅲ胶原蛋白型在皮肤、血管壁、子宫壁中含量丰富；Ⅳ型主要在晶状体中含量丰富；Ⅴ型主要在皮肤和血管壁中含量丰富。

胶原蛋白会在高温和酸水解中变性，形成变性胶原蛋白，变性胶原蛋白的三、四级结构会遭到破坏，使得胶原蛋白的活性降低。但是，现有技术还不能对胶原蛋白进行纯化，进行非变性胶原蛋白的提取。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法，用于解决现有技术不能对胶原蛋白进行纯化，进行非变性胶原蛋白的提取的问题。

本发明的具体技术方案如下：

一种非变性胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：

a)将胶原蛋白加入孵育液进行孵育，离心，得到不溶物；

b)将所述不溶物依次进行酶解、中和、盐析，得到非变性胶原蛋白；

其中，所述孵育液选自Tris-HCl溶液、Bis-Tris溶液、咪唑缓冲液或胰蛋白酶培养液。

实验结果表明，本发明采用孵育液对胶原蛋白进行孵育，可除去变性胶原蛋白，对非变性胶原蛋白进行提取，可提高胶原蛋白产品的活性。

本发明中，孵育液优选为胰蛋白酶培养液，胰蛋白酶培养液的制备方法包括：将胰蛋白酶溶于提取缓冲液中，搅拌均匀，并用水稀释得到。

提取缓冲液通过将10～50mg蛋白酶抑制剂、0～2g碘乙酰胺、0～30g EDTA和Tris混合，加入10～20mL 0.5M HCl，用水稀释得到。

胰蛋白酶在胰蛋白酶培养液中的质量浓度为0.5～3.0mg/mL，优选为2.0mg/mL。