[发明专利]一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法

权利要求书

1.一种非变性胶原蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在250mL耐热玻璃瓶中称量2g胶原蛋白样品，将胶原蛋白样品中加入100～200mL 1M盐酸胍溶液并在4℃冰箱搅拌过夜，3000rpm离心2min，除去上清液，得到第一沉淀物，重复上述步骤一次，在第一沉淀物中加入10～50mL提取缓冲液在4℃冰箱搅拌2h，3000rpm离心2min，除去上清液，得到第二沉淀物；

2)在第二沉淀物中加入50～200mL胰蛋白酶培养液后，在37℃水浴中孵育过夜，同时连续搅拌；从水浴中取出并3000rpm离心2min，除去上清液，得到不溶物，将不溶物取出冷冻干燥，并研磨成粉末状，得到粉末不溶物；

3)将粉末不溶物用pH为2的醋酸水溶液进行溶解，其中，粉末不溶物的质量与醋酸水溶液的体积比为1g：15mL；再向粉末不溶物与醋酸水溶液的混合溶液中添加蛋白酶，在4℃下进行24h酶解，每隔1h搅拌均匀，得到酶解液，其中，蛋白酶与粉末不溶物的质量比为1：100；再将酶解液过滤，向滤液中缓慢滴加10mol/L的NaOH，调节pH值至中性，再边搅拌边缓慢加入NaCl至NaCl的浓度为4～5mol/L，盐析过夜，得到盐析物；将盐析物离心，取第三沉淀物，再次水洗离心3次，每次离心3000rpm，20min，将第三沉淀物冷冻干燥，得到非变性胶原蛋白；

所述胰蛋白酶培养液的制备方法包括：将胰蛋白酶溶于提取缓冲液中，搅拌均匀，并用水稀释得到；提取缓冲液通过将10～50mg蛋白酶抑制剂、0～2g碘乙酰胺、0～30g EDTA和Tris混合，加入10～20mL 0.5M HCl，用水稀释得到。

2.一种胶原蛋白的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)采用权利要求1所述非变性胶原蛋白提取方法对胶原蛋白进行提取，得到非变性胶原蛋白；

B)将所述非变性胶原蛋白进行电泳，根据电泳结果确定所述胶原蛋白的类型。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤B)所述根据电泳结果确定所述胶原蛋白的类型具体包括：

若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白具体包括：

若所述电泳条带位于110kd、130kd和280kd，所述胶原蛋白含非变性I型胶原蛋白。

5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白具体包括：

若所述电泳条带仅位于130kd和280kd，所述胶原蛋白含非变性II型胶原蛋白。

6.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤B)之后，还包括：

步骤C)将所述非变性胶原蛋白采用圆二色谱法进行检测，确定所述胶原蛋白的二级结构。

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，步骤C)所述确定所述胶原蛋白的二级结构具体包括：

若所述非变性胶原蛋白的吸收峰值均为负值，所述胶原蛋白无三螺旋结构。