[发明专利]黄芪甲苷人工抗原及其人工抗体的制备方法和应用

说明书

本发明报道了一种黄芪甲苷的人工抗原及其高特异性人工抗体的制备方法。首先用2,2,6,6‑四甲基哌啶‑1‑氧自由基(TEMPO)氧化法将黄芪甲苷分子中葡萄糖基上C6”‑CH₂‑OH选择性氧化成‑COOH，然后再将所得的‑COOH与BSA上的氨基缩合得到人工抗原；最后用所得的人工抗原免疫动物成功制备出多克隆抗体，该抗体的效价大于1:128000，对黄芪甲苷的IC₅₀为9.89μg/mL。进一步使用5个黄芪甲苷结构类似物测定了抗体的交叉反应率，结果表明，较之传统的高碘酸钠法制备的人工抗体，本发明采用的TEMPO法制备的人工抗体的特异性更高，可用于黄芪甲苷的ELISA分析。这一工作为黄芪甲苷及的高选择半抗原设计和人工抗体制备提供了一种新办法。

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种黄芪甲苷人工抗原及其多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

苷类化合物是糖及其衍生物与另一非糖物质连接而成的一类化合物，广泛分布于植物之中。大量的皂苷、黄酮苷等糖苷类化合物已被现代药学研究证明为天然药物的有效成分，而广泛地应用于疾病治疗及保健预防领域。随着对天然糖苷的研究和应用的不断增多，对其方便、高效、灵敏的分析检测技术提出了更高的要求。但是，尽管过去几十年来以HPLC为代表的传统分析技术取得了巨大成就，但仍然存在一些缺点，如样品预处理复杂、分析时间长、仪器要求高等。免疫学检测技术具有检测速度快、费用低廉、仪器简单、灵敏度高和选择性强等优点，不但能够用于样品的定性筛选，还能进行定量测定，因此越来越多地应用于天然产物的分析研究。

免疫分析最重要的环节是制备被分析物的高特异性的人工抗体。由于绝大多数天然糖苷的分子量小(1000Da)，为半抗原而不能引起免疫反应。必须将半抗原(化合物本身或其衍生物)通过化学反应与载体蛋白共价结合，制成完全抗原(人工抗体)后才能有效地刺激机体产生特异性的抗体。半抗原设计的基本原则是尽量保持半抗原的原有分子特征结构以便能暴露在人工抗原的表面，使其能最大限度地被动物的免疫活性细胞所识别，从而刺激机体产生特异性免疫应答，产生对待测物具有高亲和力和高特异性的抗体。

对糖苷类化合物而言，最常用半抗原设计的方法是“高碘酸钠氧化法”，即先使用高碘酸钠将糖基氧化，开环转化为醛，然后与BSA的赖氨酸残基结合，脱水后形成希夫碱(如图1)。虽然采用这一方案成功合成了各种天然糖苷的人工抗原并应用于人工抗体的制备，如黄芪甲苷(Yu S.L.,et al.,Revista Brasileira De Farmacognosia,2014,24:282-287)、甘草苷(Fujii S.,et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:3377-3383)、大豆苷(Sakamoto S.,et al.,Food Chemistry,2015,169:127-133)、芍药苷(Zhao Y.,et al.,Planta Medica,2015,81:765-770)、三七皂苷R1(Limsuwanchote S.,et al.,Planta Medica,2014,80:337-342)和人参皂苷Re(Qu H.,et al.,Planta medica,2014,80:1143-1150)等。但是，由于糖基被高碘酸钠氧化破坏，化合物的结构特异性降低，从而使得相应的人工抗原的特异性降低。所得的抗体交叉反应率高，更适合于对一类化合物的分析，如大豆苷的单克隆抗体与染料木苷的交叉反应率高达82.35％(Sakamoto S.,etal.,Food Chemistry,2015,169:127-133)。到目前为止，尚无一个切实可行的方法来替代“高碘酸钠氧化”法。

黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分之一。药理学研究表明，黄芪甲苷具有可改善心肺功能、增强机体免疫力、抗病毒、抗应激等多种功效(RenS,et al.Journal ofTraditional Chinese Medicine,2013,33:413-416)。黄芪甲苷的人工抗体制备现有技术路线也采用的是“高碘酸钠氧化”法(Yu S.L.,et al.,Revista Brasileira DeFarmacognosia,2014,24:282-287)。