[发明专利]一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法

说明书

本发明公开了一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，以钩藤根、茎徒手切片进行生物碱染色，根据染色结果剥离各着色部位并测定其总生物碱，明确生物碱储存结构部位和含量，以此鉴别钩藤药材并确定药材的综合开发利用策略。传统方法采收钩藤药材时，其根、茎、叶均未被利用，造成资源极大浪费。本发明以钩藤根、茎为材料，进行生物碱染色观察及总生物碱提取，从而确定生物碱在钩藤中的积累部位及含量，并作为判定钩藤药材质量的有效方法，旨在改进其药材的传统利用方式，将根、茎、叶加以综合利用，以实现其经济效益的最大化。

技术领域

本发明涉及植物组织切片、生物碱染色及含量测定技术，具体涉及钩藤徒手切片、生物碱染色和总生物碱含量测定方法。

背景技术

钩藤[Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.]为茜草科 (Rubiaceae)钩藤属(Uncaria Schreber nom.cons.)多年生木质藤本植物，以干燥带钩茎枝入药。其味甘，性凉，归肝、心包经；有息风定惊、清热平肝等功效；用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫及头痛眩晕等症。钩藤中主要药效成分为吲哚类生物碱，包括钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、柯诺辛碱、柯南因碱等百余种，其中以钩藤碱和异钩藤碱含量较高。在钩藤采集、收购过程中，药商为避免钩藤药材掺假，而仅收购带钩枝条，其余部分被丢弃，由于钩藤根、茎及叶虽不长钩，但生物碱含量较高，被丢弃造成资源的极大浪费。

由于现有的收购过程中无法检测钩藤根、茎及叶的生物碱含量，药商为避免钩藤药材掺假，而仅收购带钩枝条，其余部分被丢弃，从而造成资源的极大浪费。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法。该发明为钩藤药材鉴别及药材资源的综合开发利用开辟了新途径，能避免钩藤药材掺假，同时减少钩藤资源的浪费等优点。

本发明的技术方案：一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，包括以下步骤：

a、以钩藤根、钩藤茎为材料，蒸馏水洗净后通过徒手切片，选择大小均匀、厚度为0.1～0.5mm的薄片置于载玻片上，分别用改良碘化铋钾染色剂、溴甲酚绿试剂及浓硝酸对钩藤根、钩藤茎切片进行染色；

b、另取钩藤根、钩藤茎洗净后，根据步骤1中生物碱染色结果，将钩藤根、钩藤茎中着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为35～75℃，烘干时间为3～8天，取出后磨粉过筛，收集备用；

c、取步骤2中钩藤粉末0.5～2.0g置于锥形瓶中，加入2～10ml氨溶液润湿10～90min，再加入甲醇，料液比为1:30～1:70g/mL，超声提取20～ 60min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准溶液，做出标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。

前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述步骤a中每个试剂的染色处理时间均为15min，染色结束，试剂均吸干后滴加蒸馏水清洗，盖上盖玻片，置于显微镜下观察生物碱积累部位，以此作为下一步组织结构剥离的依据。

前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述步骤b中根据钩藤根、钩藤茎染色结果将着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为55℃，烘干5天，磨粉过40目筛。