[发明专利]一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法

权利要求书

1.一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、以钩藤根、钩藤茎为材料，蒸馏水洗净后通过徒手切片，选择大小均匀、厚度为0.1～0.5mm的薄片置于载玻片上，分别用改良碘化铋钾染色剂、溴甲酚绿试剂及浓硝酸对钩藤根、钩藤茎切片进行染色；

b、另取钩藤根、钩藤茎洗净后，根据步骤1中生物碱染色结果，将钩藤根、钩藤茎中着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为35～75℃，烘干时间为3～8天，取出后磨粉过筛，收集备用；

c、取步骤2中钩藤粉末0.5～2.0g置于锥形瓶中，加入2～10ml氨溶液润湿10～90min，再加入甲醇，料液比为1:30～1:70g/mL，超声提取20～60min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准溶液，做出标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。

2.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述步骤a中每个试剂的染色处理时间均为15min，染色结束，试剂均吸干后滴加蒸馏水清洗，盖上盖玻片，置于显微镜下观察生物碱积累部位，以此为下一步组织结构剥离的依据。

3.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述步骤b中根据钩藤根、钩藤茎染色结果将着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为55℃，烘干5天，磨粉过40目筛。

4.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述步骤c中，称取1g钩藤粉末于锥形瓶中，加入5ml氨溶液润湿30min，再加入甲醇，料液比为1:50g/mL，超声提取40min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4mL，定容至25mL，并在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。

5.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：步骤c中所述的pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL由0.2mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液25ml与0.1mol/L盐酸6ml混合，加蒸馏水稀释至100ml制得，PH为3.6。

6.根据权利要求1或4所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：步骤c中所述的萃取剂为三氯甲烷。

7.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述改良碘化铋钾染色剂为0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸和40mL蒸馏水中，再与20mL40％的碘化钾混合。

8.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述氨溶液由氨水、蒸馏水、无水乙醇按体积比9:30:16的比例配制而得。

9.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述溴甲酚绿试剂由0.1g溴甲酚绿溶于2.8ml，0.05mol/LNaOH溶液中，蒸馏水定容至200ml制得。