[发明专利]DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法和表达纯化方法

说明书

本发明提供了DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，该DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法为构建DNA拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株，然后进行表达纯化。本方采用重组蛋白制备技术，制备天花病毒的DNA拓扑异构酶Ⅰ，该蛋白具有识别特异性DNA序列5’‑(T/C)CCTT‑3’的特点，且制备过程简便，成本低，为DNA拓扑异构酶Ⅰ的研究和应用奠定基础。本发明有以下特点：产量高：可达到1mg/g菌体的收率；制备简便：两步纯化即获得纯度高，核酸残留检测合格的样品，工艺简便易于重复；具有位点特异性：能够切割特定序列且样品活性稳定。本发发明还提供了DNA拓扑异构酶Ⅰ的纯化方法。

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞工程领域，特别涉及DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备。

背景技术

DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase)，普遍存在于各类生物种群中，这类酶能够调节核酸空间结构动态变化，在DNA的转录，复制以及修复等重要的活动中发挥作用，因此它们是控制核酸生理功能的关键酶，其生理学特性与肿瘤相关性的研究引起人们的广泛关注。DNA拓扑异构酶Ⅰ是催化DNA在不同拓扑异构结构质之间转换的蛋白，真核生物的DNA拓扑异构酶Ⅰ对特定的核酸序列仅仅表现出一定的偏好性，对特定序列的识别能力未有报道，对其作为体外实验工具酶的实用性带来了限制。

发明内容

为了解决现有各种方法的不足，本发明其中一方面开发了针对真核DNA拓扑异构酶Ⅰ的缺点，本发明采用重组蛋白制备技术，制备天花病毒的DNA拓扑异构酶Ⅰ，该蛋白具有识别特异性DNA序列5’-(T/C)CCTT-3’的特点，且制备过程简便，成本低，为DNA拓扑异构酶Ⅰ的研究和应用奠定基础。

本发明有以下特点：

产量高：可达到1mg/g菌体的收率；

制备简便：两步纯化即获得纯度高，核酸残留检测合格的样品，工艺简便易于重复；

具有位点特异性：能够切割特定序列且样品活性稳定。

本发明其中一个技术方案提供了一种DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法为构建DNA拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株，然后进行表达纯化。

本发明其中一个技术方案提供了一种DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，上述拓扑异构酶Ⅰ到原核表达载体使用pet30a，工程菌为BL21(DE3)。

本发明其中一个技术方案提供了一种DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，其中拓扑异构酶Ⅰ为重组DNA拓扑异构酶Ⅰ其氨基酸序列如SEQ ID No.3：

MRALFYKDGKLFTDNNFLNPVSDNNPAYEVLQHVKIPTHLTDVVVYGQTWEEALTRLIFVGSDSKGRRQYFYGKMHVQNRNAKRDRIFVRVYNVMKRINCFINKNIKKSSTDSNYQLAVFMLMETMFFIRFGKMKYLKENETVGLLTLKNKHIEISPDKIVIKFVGKDKVSHEFVVHKSNRLYKPLLKLTDDSSPEEFLFNKLSERKVYECIKQFGIRIKDLRTYGVNYTFLYNFWTNVKSISPLPSPKKLIALTIKQTAEVVGHTPSISKRAYMATTILEMVKDKNFLDVVSKTTFDEFLSIVVDHVKSSTDGLEHHHHHH。

本发明其中一个技术方案提供了一种DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法，表达纯化步骤如下：

步骤1，将获得的菌种1：100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD600＝0.6时，加入1mM IPTG诱导表达，同时低温诱导表达，转离心收菌；

步骤2破菌，菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合，超声破菌，转离心收集上清。