[发明专利]一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法

权利要求书

1.一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)从平板上挑取一个新活化的大肠杆菌单菌落至3ml 2YT液体培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养12～16h；

2)将培养过夜的3ml小量菌液转接到装有300ml 2YT液体培养基(添加葡萄糖)的1000ml三角瓶中，30℃，225rpm振荡培养至OD600值为0.4～0.6；

3)将扩增的300ml大量菌液转移到预冷的50ml无菌离心管中，于室温以3650rpm离心5min，收集细菌沉淀，弃上清；

4)50ml冰水洗细菌沉淀，随后于室温以3650rpm离心5min，收集细菌，弃上清；

5)重复步骤4)一次；

6)倒扣离心管于无菌吸水纸上5min，使液体流尽，回收菌体；

7)加入20ml预冷的缓冲液I，枪头反复吹打均匀以重悬菌体，冰浴30min，随后于室温以3650rpm离心5min，回收菌体；

8)用1ml预冷的缓冲液I重悬细菌，即得大肠杆菌感受态细胞。100μl/管分装在1.5mlEP管中，-80℃保存备用；

9)取一管上述大肠杆菌的感受态细胞，取25μl进行转化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)单菌落小量培养时的条件为：37℃，250rpm，12～16h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)2YT液体培养基(添加葡萄糖)的配制方法：在950ml灭菌的2YT液体培养基中加50ml除菌的1mol/L葡萄糖溶液，配成50mmol/L 2YT含糖液体培养基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)细菌扩大培养时的条件为：30℃，225rpm，OD600值＝0.4～0.6。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)将细菌大量培养时的培养液转移到预冷的离心管中，室温，3650rpm离心5min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)和5)50ml冰水洗细菌沉淀，室温，3650rpm离心5min，洗2次。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)缓冲液I为包含以下成分的水溶液：1mM氯化钙、1mM氯化镁和1M山梨醇。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)在细菌沉淀中加入20ml预冷的缓冲液I，冰浴30min。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)室温，3650rpm离心5min。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤8)用1ml预冷的缓冲液I重悬细菌，即得大肠杆菌感受态细胞。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤9)取25μl感受态细胞进行转化。