[发明专利]一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括下述步骤：从平板上挑取大肠杆菌单菌落于37℃，250rpm振荡培养12～16h；将培养过夜的3ml菌体转接到大瓶，30℃，225rpm振荡培养至OD600值为0.4~0.6；收集细菌沉淀，50ml冰水洗涤，回收菌体；加入预冷的缓冲液I，枪头反复吹打重悬菌体，冰浴30min；最后菌体用1ml预冷的缓冲液I重悬即得大肠杆菌感受态细胞。100μl/管分装在1.5ml EP管中，‑80℃保存备用。利用本发明制备的感受态细胞转化率高，且操作简便、成本低廉。

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

背景技术

感受态是指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态。常态的大肠杆菌细胞不能摄入外源DNA，需特殊处理（如CaCl₂、RuCl等化学试剂）使细菌的细胞壁膨胀，细胞膜通透性改变，从而使外源DNA进入，这样的细胞就是感受态细胞(competent cell)。制备感受态细胞是分子生物学研究的一个重要环节，影响后续测序和载体构建等实验的开展。新鲜幼嫩的对数生长期细胞是制备感受态细胞的关键。

将外源DNA导入受体细胞，使之获得新的遗传性状的过程称为转化。重组DNA分子能否转化，一方面取决于供体菌与受体菌的亲缘关系，另一方面还与受体菌的生理有关。转化效率是评价感受态细胞优劣的标准之一。

1972年Cohen发明的CaCl₂法是目前实验室制备感受态细胞的常规方法，该方法简便易行，但转化效率较低，只用于常规分子生物学实验，不能满足DNA文库构建和大片段DNA的转化；RbCl/KCl法的感受态细胞转化效率较高，但需要特殊的试剂RbCl，限制了该方法的推广；Hanahan法对实验人员的操作技巧和试剂要求高，重复性不高；1990年Inoue H.等提出的Inoue法的转化效率较高，但对细菌OD600值要求高，而且培养温度要控制在18℃，培养时间长达20-50h，操作过程相对繁琐；也有实验室使用改良的TFB或者FB法，就是添加很多微量离子来提高转化率，但缓冲液配制繁琐，而且成本高，难以被广泛采纳；电击转化法依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率高。但电穿孔法需要特殊的电转仪，一般实验室不具备开展电转实验的条件。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的旨在提供一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，该方法不仅转化效率高，而且成本低，易于操作，稳定性好，能普遍推广使用，对分子克隆实验具有重要的指导意义。

为了实现以上发明目的，本发明的技术方案如下：

一种简便、高效的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)从平板上挑取一个新活化的大肠杆菌单菌落至3ml 2YT液体培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养12～16h；

2)将培养过夜的3ml小量菌液转接到装有300ml 2YT液体培养基(添加葡萄糖)的1000ml三角瓶中，30℃，225rpm振荡培养至OD600值为0.4~0.6；

3)将扩增的300 ml大量菌液转移到预冷的50ml无菌离心管中，于室温以3650rpm离心5min，收集细菌沉淀，弃上清；

4)50ml冰水洗细菌沉淀，随后于室温以3650rpm离心5min，收集细菌，弃上清；

5)重复步骤4)一次；

6)倒扣离心管于无菌吸水纸上5min，使液体流尽，回收菌体；

7)加入20ml预冷的缓冲液I，枪头反复吹打均匀以重悬菌体，冰浴30min，随后于室温以3650rpm离心5min，回收菌体；