[发明专利]基于核酸适配体的肿瘤检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了基于核酸适配体的肿瘤检测方法及试剂盒。本发明提供了试剂盒，包括核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体，所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。本发明的基于核酸适配体磁性纳米颗粒技术用于外周血中高表达碱性磷酸酶的循环肿瘤细胞、外泌体和自由碱性磷酸酶捕获和检测的方法，可以实现对目标细胞、外泌体或自由蛋白高选择性的捕获及检测。磁性纳米颗粒既可起到尺寸放大作用，用于富集，还可用于磁分离实现高效率捕获。通过利用碱性磷酸酶自身与显色底物的酶反应，对分离得到的目标物进行可视化检测，实现了信号放大，提高了灵敏度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于核酸适配体的肿瘤检测方法及试剂盒。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP或AKP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化的过程发挥了重要作用。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已知人类同工酶包括：组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)，肠型碱性磷酸酶(IAP)，胎盘型碱性磷酸酶(PALP)和类胎盘型碱性磷酸酶(GCAP)。血清碱性磷酸酶正常人血清中的碱性磷酸酶主要来自肝和骨骼，碱性磷酸酶测定主要用于诊断肝胆和骨骼系统疾病，是反映肝外胆道梗阻、肝内占位性病变和佝偻病的重要指标。

碱性磷酸酶异源二聚体在结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、宫颈癌等肿瘤组织中高表达。游离的碱性磷酸酶异源二聚体、含有碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体或循环肿瘤细胞可以从原发性肿瘤或转移病灶释放到血流中。因此，检测游离的碱性磷酸酶异源二聚体、外泌体或循环肿瘤细胞将有助于肿瘤的早期诊断和筛查、监测术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化治疗的策略。

循环肿瘤细胞是指恶性肿瘤在发展过程中传播并存活于外周血中的肿瘤细胞，与肿瘤的转移和预后密切相关。循环肿瘤细胞检测是指对肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞进行分析的方法，在外周血中检到循环肿瘤细胞是预示肿瘤转移最直接、重要的方法，在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。循环肿瘤细胞的发现有望改变临床上仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志物的现状。由于外周血中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，故对检测技术的灵敏度和选择性提出了极高的要求。目前用于循环肿瘤细胞检测的方法很多，首先通过密度梯度离心法、细胞过滤或黏附技术、免疫磁珠分离技术和微流控芯片技术等方法分离富集得到循环肿瘤细胞，再通过免疫细胞化学技术、逆转录聚合酶链反应和流式细胞术等对循环肿瘤细胞进行检测。目前美国食品和药品管理局(FDA)唯一批准的检测循环肿瘤细胞的方法是CellSearch系统，虽然能够实现循环肿瘤细胞的捕获与检测，但仍然要进一步提高灵敏度和特异性，并且实现方法的快速简便高通量。

外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的研究发现，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移，所以外泌体的检测和研究得到了越来越多的关注。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体，

所述核酸适配体或其衍生物为如下1)-7)中任一种：

1)序列1所示的单链DNA分子；

2)将1)所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

3)将1)所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；