[发明专利]在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株

说明书

本发明涉及一种细菌菌株，其含有编码重组蛋白的开放阅读框，从而控制功能性启动子。本发明的特征在于该细菌菌株含有编码突变的肽聚糖相关的脂蛋白(PAL蛋白)的开放阅读框，从而控制功能性启动子，其中所述PAL蛋白被突变，使得PAL蛋白不含细菌外细胞膜的膜锚。本发明还涉及编码重组蛋白和突变的PAL蛋白的质粒，并且涉及一种使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法。以这种方式，与现有技术相比，可以在不导致细菌细胞大量死亡的情况下实现增加的培养残余物中的产物产量。

技术领域

本发明涉及一种含有在功能性启动子的控制下编码重组蛋白的开放阅读框的细菌菌株，其特征在于该细菌菌株含有在功能性启动子的控制下编码突变的肽聚糖相关的脂蛋白(Pal蛋白)的开放阅读框，Pal蛋白已经突变使得其不具有细菌外细胞膜的膜锚。本发明还涉及一种编码重组蛋白和突变的Pal蛋白的质粒，并且涉及一种使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法。

背景技术

与哺乳动物细胞培养相比，重组蛋白在细菌中的生成时间短且操作简单，因此可以在细菌中经济高效地生产重组蛋白。由于其广泛研究的遗传学和生理学，革兰氏阴性肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)是目前生产重组蛋白最常用的生物。特别有吸引力的是在大肠杆菌中生产重组蛋白的方法，其中目标蛋白以高产量和正确折叠方式直接释放到发酵培养基中，因为这避免了复杂的细胞破碎和蛋白质折叠过程。文献中公开了一系列大肠杆菌菌株以及使用大肠杆菌菌株实现重组蛋白向培养基中释放的方法。

i)首先，有可能使用所谓的“泄漏(leaky)”菌株。这些应理解为是指在外膜上有缺陷并因此将周质蛋白部分地排放到培养基中的大肠杆菌突变体。这是一种非特异性机制。此类“泄漏”突变体的一个例子是在Tol-Pal复合体中具有缺陷的菌株，例如tol-和pal-缺失突变体。已知tol-和pal-缺失突变体将细胞内源性周质蛋白释放到发酵培养基中，诸如例如碱性磷酸酶PhoA或RNase I。这种菌株对EDTA、各种洗涤剂和抗生素极为敏感，并表现出生长缺陷(Lazzaroni和Portalier 1981,J.Bact.145,第1351-1358页；Lazzaroni和Portalier 1992,Mol.Microbiol.6,第735-742；Chen et al.2014,Microb.Biotechnol.7,第360-370页；Bernstein et al.1972,J.Bacteriol.112,第74-83页)。因此，它们仅有限适合于在高细胞密度发酵条件下培养。

ii)实现重组蛋白释放的另一方法是表达可渗透大肠杆菌的细胞被膜的蛋白，从而促进蛋白向培养基中的释放。细菌素释放蛋白(BRP)(一种导致外膜降解和细胞裂解的小脂蛋白)的表达已被充分地描述。通过过表达ColE1 BRP(Kil蛋白)或阴沟肠道菌素DF13BRP，可以将白介素-2、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶或β-内酰胺酶排放到培养基中(Beshay etal.2007,Biotechnol.Lett.29,第1893-1901页；Robbens et al.1995,ProteinExpr.Purif.6,第481-486页；Sommer et al.2010,J.Biotechnol.145,第350-358页)。

iii)Wan和Baneyx描述了另一种使细胞被膜不稳定的方法(1998,ProteinExpr.Purif.14,第13-22页)。这涉及通过过表达TolA蛋白(TolAIII)的可溶性C-末端结构域来破坏膜完整性。这导致了与tolA-缺失突变体类似的表型，蛋白RNase I和碱性磷酸酶从周质向培养基的释放增加，并且导致对脱氧胆酸盐敏感(Levengood-Freyermuth etal.1993,J.Bacteriol.175,第222-228页)。通过TolAIII蛋白的过表达，OmpA-TEM-β-内酰胺酶蛋白的释放明显增加。然而，与对照相比，β-内酰胺酶的表达降低了1.5-2倍。此外，正如在tolA突变体中一样，TolAIII的表达大大损害了细胞的活力。TolAIII表达开始后3小时，摇瓶中作为培养物活力量度的菌落形成单位(CFU)数降低了1000倍。此外，细胞对低浓度的SDS(0.02％)敏感，表明存在明显的膜缺陷。