[发明专利]包含RNA治疗剂的外泌体

说明书

本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗剂，其中所述EV包含基于核酸(NA)的治疗剂，例如m RNA、环状RNA、mi RNA、sh RNA、环状RNA和/或DNA分子。使用本发明的工程化改造蛋白和NA工程策略将NA治疗剂加载到EV中，以增强到EV中的加载并促进NA货物分子在靶细胞内的释放。

技术领域

本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗剂，其中EV包含内源性加载的RNA治疗剂，例如mRNA、环状RNA、miRNA、shRNA和各种其它RNA治疗剂。

背景技术

基于核酸的治疗剂正迅速进入临床应用。基因疗法、基于mRNA的疗法、基于短寡核苷酸和siRNA的疗法只是RNA疗法领域内众多模式中的一些实例。裸核酸(通常为RNA)由于清除速度快、具有核酸酶活性、缺乏器官特异性分布以及细胞摄取效率低而难以在体内递送，因此通常必须使用专门的递送载体作为实现生物活性递送的手段。对于非肝靶标和高分子量RNA治疗剂(例如mRNA和基因疗法)尤其如此。

细胞外囊泡(例如外泌体)通常是由大多数细胞类型产生的纳米大小的囊泡，并充当人体用于细胞间蛋白质、核酸、肽、脂质和各种其它分子的天然转运系统。含RNA的EV具有多种潜在的治疗用途，并且已经被研究用作基因疗法、mRNA递送和各种环境中短核酸递送的递送载体。WO2010/119256代表使用外泌体的核酸递送领域中的基础发明，并且所述申请教导了外泌体用于递送几种类型的核酸货物的实用性。未公开的申请PCT/GB2017/051479教导了借助于RNA结合蛋白内源性加载各种类型的RNA治疗剂的改进方法，该方法将目标RNA拖到在亲本细胞内形成的EV中。US14/502,494代表另一种利用RNA结合蛋白加载某些RNA种类的方法，即利用所谓的“靶向和模块化外泌体加载(TAMEL)”系统。

然而，尽管取得了这些进步，但是在本领域中仍然存在以特定且高效的方式改进将大和小的RNA货物加载到EV中的巨大空间。此外，任何递送系统的关键方面都在于将生物活性实际递送到靶细胞中，而现有技术在这方面也有改进的空间。

US14/502,494和相应文献参考(Hung和Leonard，《细胞外囊泡杂志》(Journal ofExtracellular Vesicles)2016,5:31027)中描述的TAMEL加载系统具有本发明试图克服的多种缺点。TAMEL系统的主要缺点在于其不能实现mRNA的功能性递送，即当细胞暴露于这些外泌体时，由TAMEL系统加载到外泌体中的mRNA无法被细胞翻译。本申请实现了货物mRNA的生物活性递送。

Tutucci等人(一种改进的精确报告mRNA生命周期的MS2系统(An improved MS2system for accurate reporting of the mRNA life cycle)，《自然方法(NatMethods)》，2018年1月；15(1):81-89)讨论了MS2蛋白用于研究RNA定位和生命周期的用途，并指出TAMEL系统所使用的MS2蛋白质以很高的亲和力结合RNA。本文报告这种紧密结合对于mRNA调节的研究是有问题的。推测在EV加载的情况下，这种高亲和力结合仍然是有问题的，因为MS2的紧密结合意味着加载的任何RNA/核酸都不会被释放。阻止mRNA的释放将会阻止正常的翻译，这可以解释为什么在US14/502,494中没有观察到mRNA的翻译。

TAMEL系统似乎并未向所有外泌体加载核酸，而已加载核酸的外泌体也只加载了非常少量的核酸(这种可变的和低水平的加载的缺点将在下面详细讨论)。这些可变的和低水平的加载结合以下事实，即所加载的核酸非常少，几乎不可能被释放，因此不具有生物活性，这意味着TAMEL系统具有多种缺点。TAMEL系统不适用于临床相关量的生物活性核酸的加载和递送。本发明克服了这些重大的缺点。

TAMEL系统的另一个缺点是它使用噬菌体蛋白质，当所生产的EV递送给患者时，噬菌体蛋白质可能会引起不良的免疫反应。本发明也克服了这种重大的缺点。

发明内容