[发明专利]修饰的细菌孢子

权利要求书

1.一种将至少一个异源基因引入产孢子细菌中，并且使所述细菌在胸腺嘧啶或胸苷不存在下无法增殖的方法，所述方法包含：

(i)将异源基因引入产孢子细菌内的胸苷酸合酶基因中；并且

(ii)在甲氧苄啶存在下使所述产孢子细菌生长。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述产芽孢细菌是芽孢杆菌属(Bacillus Spp.)，优选是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，或梭菌属(Clostridium Spp.)，优选是艰难梭菌(C.difficile)。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

步骤(i)是将异源基因引入芽孢杆菌属中的thyA基因和thyB基因中。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：

步骤i)是将异源基因引入芽孢杆菌属中的thyA基因或thyB基因中。

5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包含：

(iii)将异源基因引入所述芽孢杆菌属中的thyA基因或thyB基因中的另一个中；并且

(iv)在甲氧苄啶存在下使所述芽孢杆菌属生长。

6.根据权利要求5所述的方法，其中：

步骤(i)是将异源基因引入芽孢杆菌属中的thyA基因中；并且

步骤(iii)是将异源基因引入芽孢杆菌属中的thyB基因中。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

在步骤(ii)期间，所述产孢子细菌在包含浓度低于2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml或0mg/ml的酵母提取物(YE)的培养基中生长，优选地，所述产孢子细菌在其中生长的所述培养基不含YE。

8.根据权利要求5至6中任一项所述的方法，其中：

在步骤(iv)期间，所述芽孢杆菌属在包含浓度低于2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml或0mg/ml的酵母提取物(YE)的培养基中生长，优选地，所述芽孢杆菌属在其中生长的所述培养基不含YE。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

在步骤(ii)期间，所述产孢子细菌在包含胸腺嘧啶或胸苷的培养基中生长。

10.根据权利要求5、6或8中任一项所述的方法，其中：

在步骤(iv)期间，所述芽孢杆菌属在包含胸腺嘧啶或胸苷的培养基中生长。

11.根据权利要求5、6、8或10中任一项所述的方法，其中：

在步骤(iv)中存在的甲氧苄啶的量高于在步骤(ii)中存在的甲氧苄啶的量。

12.根据权利要求6所述的方法，其中在thyA基因座携带插入的细胞由在有或无胸腺嘧啶或胸苷的情况下能够在37℃下生长，但除非补充有胸腺嘧啶或胸苷，否则不能在46℃下生长来验证。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

YE以低于2mg/ml的浓度存在于在所述方法的任何阶段使用的培养基中，或优选不存在。

14.根据权利要求5、6、8、10或11中任一项所述的方法，其中：

在步骤(iv)期间，所述芽孢杆菌属在补充有至少一种氨基酸的培养基中生长。