[发明专利]酶筛选方法

说明书

本发明涉及使用基于纳米孔的测序以多重方式推导至少两种不同的酶变体的多种动力学参数(240)的组合物和方法。在一些实施方案中，所述系统和方法可用于筛选不同的纳米孔变体，或纳米孔变体和酶变体两者的不同组合。

关于联邦资助的研究的声明

本发明用美国国家科学基金会授予的1445570下的政府支持进行。政府在本发明中具有某些权利。

相关申请的交叉引用

本发明要求在2017年8月23日提交的美国临时专利申请号62/549,246的申请日的权益，所述美国临时专利申请的公开内容在此以其整体通过引用并入本文。

发明背景

DNA测序的重要性自四十年前其开始时已急剧增加。其被认为是生物学和医学的大多数领域的关键技术，且被认为是个性化和精准医学的新范式的基础。关于个体的基因组和表观基因组的信息可以帮助揭示他们的疾病倾向、临床预后以及对治疗法的应答，但基因组测序在医学中的常规应用将需要以及时且经济有效的方式提供全面的数据。

基于纳米孔的核酸测序是已被广泛研究的方法。在过去的二十年中，已非常关注利用纳米孔用于聚合物表征和用于以低成本、快速、单分子的方式区分核苷酸。例如，Kasianowicz等人表征单链多核苷酸，因为它们通过嵌入脂质双层中的α溶血素纳米孔电移位(参见，例如，Kasianowicz, J. (1996), Characterization of IndividualPolynucleotide Molecules using a Membrane Channel. Proc. Natl. Acad. Sci.,93, 13770-3)。据表明，在多核苷酸移位期间，随着离子电流的降低，可以测量纳米孔孔径的部分阻断。类似地，Gundlach等人证明了一种测序DNA的方法，其结合被称为双链体中断测序的过程使用源自耻垢分枝杆菌的低噪声纳米孔(“MspA”)(参见，例如，Derrington, I.等人 (2010), Nanopore DNA Sequencing with MspA. Proc. Natl. Acad. Sci., 107(37), 16060-16065)。此处，使用双链双链体将核酸的单链部分暂时保持在MspA压缩物中。Akeson等人 (参见，例如，PCT公开号WO/20150344945)公开了用于表征纳米孔中的多核苷酸的方法，其利用邻近定位的分子马达来控制多核苷酸通过或邻近纳米孔孔的移位速率。

一般地，已经追求三种纳米孔测序方法：链测序，其中当DNA的碱基依次穿过纳米孔时鉴别它们；基于外切核酸酶的纳米孔测序，其中核苷酸从DNA分子被一个接一个酶促切割并且当它们被纳米孔捕获并穿过纳米孔时进行监测；和纳米孔边合成边测序(SBS)方法，其中可鉴别的聚合物标签附接至核苷酸并在酶催化的DNA合成期间在纳米孔中记录。所有这些方法共同的是需要精确控制反应速率，使得按顺序确定每个碱基。链测序需要用于减慢DNA穿过纳米孔和解码通道内的多个碱基的方法；为此目的，已经开发了利用分子马达的棘轮方法。基于外切核酸酶的测序需要释放足够接近孔的每个核苷酸，以确保其捕获和其以足够慢的速率通过孔转运，以获取有效的离子电流信号。另外，这两种方法均依赖于四种天然碱基(两种相对类似的嘌呤和两种类似的嘧啶)之间的区别。纳米孔SBS方法利用附接至核苷酸的合成聚合物标签，其经专门设计以产生独特且容易区分的离子电流阻断特征用于序列测定。

DNA聚合酶是通过从亲本模板合成新的互补DNA链而复制遗传信息、由此保持遗传信息的酶。迄今为止，已经通过定向进化生成聚合酶突变体，并且用于DNA聚合酶突变体的大规模筛选的方法已经是诱变、噬菌体展示和隔室化的自我复制方法。这已经导致鉴别和开发不同的聚合酶用于许多生物技术应用。

发明概述