[发明专利]编码信使核糖核酸(mRNA)的稳定核酸

说明书

本公开涉及聚腺苷酸化(聚A)尾的领域。在一些实施例中，DNA编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚A尾，其中所述聚A尾包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。

技术领域

本公开涉及稳定的信使核糖核酸(mRNA)和编码稳定的mRNA的DNA的领域。

背景技术

聚腺苷酸化是在信使RNA(mRNA)的3’端添加多个腺嘌呤核苷酸，从而形成聚A尾的过程。所述聚A尾由多个重复腺嘌呤核苷酸(例如单磷酸腺苷)组成，而没有其它碱基中断序列。聚A尾对于mRNA的核输出、翻译和稳定性至关重要。在自然界中，当mRNA从DNA产生时，末端转移酶将腺嘌呤核苷酸添加到mRNA的3’端。当离体产生mRNA时可应用此酶促过程，但所述过程难以控制而且产生不同长度的聚A尾。通过在质粒中编码聚A尾，有可能降低聚A尾中的异质性。然而，该过程不会消除异质性，而且具有其它缺点，例如质粒的潜在不稳定性。

聚A尾充当聚A结合蛋白的结合位点。聚A结合蛋白有助于从细胞核输出mRNA、翻译并抑制mRNA的降解。在没有从细胞核输出的情形下，mRNA通常被外来体降解。聚A结合蛋白募集翻译所需的蛋白质。

mRNA现在被用作治疗分子，例如用于治疗各种疾病和失调。mRNA代替蛋白质递送给受试者，从而使得受试者的细胞在细胞内产生由所述mRNA编码的蛋白质。出于这些和其它目的，可通过从通常含于质粒中的DNA模板转录来制备mRNA。在mRNA生产期间，聚A尾可在从质粒转录后酶促地添加到mRNA或在质粒自身上编码。当在质粒上编码聚A尾时，聚A尾可能在质粒DNA复制的循环中变得更短(即，丢失腺嘌呤核苷酸)，这可能导致所得DNA和后续mRNA群体中巨大的变化。因此，本领域需要设计编码聚A尾的质粒，所述质粒在DNA复制期间是稳定的，并且抵抗编码聚A腺嘌呤核苷酸的核苷酸的逐渐丢失。

发明内容

本文公开了编码聚腺苷酸化(聚A)尾的DNA和包含聚腺苷酸化(聚A)尾的mRNA，所述聚腺苷酸化(聚A)尾包含位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的连续腺嘌呤核苷酸，其中通过插入非腺嘌呤核苷酸“锚”来稳定所述聚A尾。

如本文所用，术语“聚A尾”是指mRNA分子上的聚A尾，或DNA质粒内编码聚A尾的序列。聚A尾可由质粒内的互补DNA序列编码。DNA序列中的重复胸腺嘧啶(T)核苷酸的序列(例如均聚物T序列)可编码mRNA上的聚A尾。两个或更多个连续腺苷(例如腺苷或去氧腺苷)、胸苷或其它核苷酸称为均聚物。天然聚A尾包含长的、不间断的均聚物A序列。

本文所公开的非腺嘌呤核苷酸锚以规则或不规则隔开的间隔中断聚A尾并稳定编码所述聚A尾的DNA以及从所述DNA产生的mRNA。示例性非腺嘌呤核苷酸锚提供于表4中。例如，锚序列与聚A尾内的两个腺嘌呤核苷酸均聚物序列毗邻。

在一些实施例中，涵盖DNA组合物，其包含编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚腺苷酸化(聚A)尾的核苷酸，其中所述聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤(A)核苷酸和一个或多个非腺嘌呤(A)核苷酸。

在一些实施例中，聚A尾包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90个连续腺嘌呤核苷酸。

在一些情况中，与包含仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的3’尾的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止DNA复制期间一个或多个腺嘌呤核苷酸的丢失。

在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸经定位以中断连续腺嘌呤核苷酸，使得聚(A)结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸的区段。

在一些实施例中，聚A尾包含至少总共50个腺嘌呤核苷酸。

在一些实施例中，聚A尾包含总共40-500个腺嘌呤核苷酸。

在一些情况中，聚A尾包含总共95-100个腺嘌呤核苷酸。