[发明专利]高分辨率的微生物分析方法

说明书

提出了一种对宏基因组序列进行分箱的方法，该方法利用来自单分子长读长测序技术的长读长，并利用由这些读长推测出的DNA甲基化标志物，以将单个读长和重组重叠群分辨为物种水平和品系水平的聚类。提出了一种对微生物组样品中的原核生物进行去卷积的方法。还提出了一种将微生物基因组中的可移动遗传元件映射至其宿主生物的方法。

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年6月28日提交的美国临时专利申请号62/525,908的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的政府支持GM114472的帮助下完成的。政府对本发明享有某些权利。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年7月19日，名为242096_000034_SL.txt，大小为17,725字节。

技术领域

整体上，本发明主题涉及基因组学和宏基因组学领域，尤其涉及使用DNA甲基化和单分子长读长的宏基因组分箱(binning)。

背景技术

人们越来越认识到人类微生物组(microbiome)可以深刻地影响我们的健康，但是对这些微生物种群的全面表征仍然很困难。16S rRNA基因的扩增子测序提供了一种鉴别宏基因组样品中存在的许多类群(taxa)的无需培养的方法，但该技术的系统发育分辨率(phylogenetic resolution)受到限制，并且该单一基因之外的微生物基因组结构未被研究或仅间接推测出。完整宏基因组的鸟枪法测序(shotgun sequencing)用扩展到菌株水平的系统发育分辨率可以获得组成生物的所有基因组特征，包括细菌和古细菌的染色体、质粒、转座子，甚至噬菌体。但是，多种技术挑战阻碍了对短读长(short read)新一代测序(NGS，next-generation sequencing)方法收集的宏基因组测序数据的解释。

NGS数据通常由数百万个长度＜200bp的读长(read)组成，提供了可观的测序深度，但是分辨复杂重复序列和存在于多个基因组中的相似序列的能力有限。这对于从头(denovo)宏基因组组装(metagenomic assembly)和对由此产生的成千上万的小的组装序列(称为重叠群(contig))的解释提出了严峻挑战，对这些小的组装序列的解释严重依赖于基于参考的注释方法或通过称为宏基因组分箱的过程分离为假定的类群。无监督(无参考)方法具有识别新物种的潜力，这不同于需要将现有参考用于训练分箱算法的有监督的分箱方法。几种无参考方法尝试通过使用k-mer频次度量来评估序列组成分布或通过跟踪多个样品之间的k-mer协方差，在从头组装前对宏基因组读长进行分箱。这些方法不依赖于从头组装的结果，但分箱分辨率受到标准NGS技术的短读长中发现的信息内容的限制。

由于短读长中有限的信息内容，大多数无参考的分箱方法转而利用组装的重叠群的较长序列。基于组成的重叠群分箱方法不仅依赖于成功的从头组装，而且当样品包含多个高度相似的细菌基因组时，也常常无法分离序列。差异覆盖(或覆盖协方差)方法基于序列在多个样品上的相似丰度分布来划分序列，这为研究大量复杂样品的项目中的序列分箱提供了强大的手段。但是，它们有时无法分开(untangle)样品中具有相似丰度的生物体基因组，并且无法有效地将独立复制的可移动遗传元件(MGE，mobile genetic element)(例如，质粒、转座子、噬菌体以及I组内含子和II组内含子)进行分箱，这些可移动遗传元件的丰度水平与其宿主染色体的差异可能很大。一种替代方法涉及使用Hi-C染色体相互作用图来连接组装的重叠群，包括MGE，但是这些方法也因难以区分密切相关的生物而受到限制(由于高度序列相似性和不均匀的Hi-C连接密度)。