[发明专利]具有用户定义的功能的哺乳动物启动子的计算机设计

说明书

基因调控的简化模型是哺乳动物合成生物学的基本要求。然而，在转录水平上，这受到控制启动子活性动力学的复杂设计规则的阻碍，从而阻止了从头设计具有用户定义的功能的调控元件。如本文所证明，当复合转录因子结合位点不能协同作用时，可以根据简单的设计规则来构建哺乳动物启动子。对宿主细胞转录机制组件进行计算机分析，以鉴定具有所需表达动力学的转录因子。然后在同型和异型结构中全面测试同源结合位点，以评估模块性并确定每个位点的单个拷贝表现出的转录活性。当特异性选择元件以防止组合相互作用时，可以简单地根据组成结合位点拷贝数对异型启动子活性准确地建模。因为结合位点顺序、间距和取向对启动子活性的影响极小，因此可以根据情况特定的设计标准，在计算机上对区块进行最佳组合和排列。为了证明这一点，从头产生CHO细胞启动子，这些启动子在体外表现出设计的活性水平和长期表达稳定性。这些发现揭示了对真核转录调控机制的新见解，并为哺乳动物合成生物学提供了新的工具。

背景技术

情况特定的启动子性能是启动子活性动力学、长期基因表达盒行为(例如沉默的倾向，与其他遗传组件的相容性(1))和启动子-细胞相互作用(例如对细胞过程的脱靶效应，例如通过隔离转录机制组件(2，3))的函数。鉴于自然进化序列的固有局限性，例如不期望的大小和不可预测的表达动力学，典型地对于大多数应用而言优选合成启动子。最简单的合成启动子构建方法涉及通过去除(4，5)、插入(6，7)或突变(8，9)序列元件来增强现有启动子的功能(有关合成启动子构建方法的全面综述，参见(10))。然而，虽然这种策略使得内源/病毒启动子性能逐步改善，但不太可能通过重组工程(re-engineering)针对功能对次优起始序列进行全面优化。相反，完全合成的构建体的自下而上构建使得启动子设计空间得以大规模扩展。

完全合成的系统包括合成转录因子(即锌指(11)、转录激活因子样效应子(12)、嵌合体(13)和CRISPR转录因子(14))，这些转录因子反式激活包含转录因子的同源结合位点(转录因子调控元件(TFRE))的合成启动子，这些完全合成的系统施加最小的宿主细胞-启动子相互作用。然而，相关的代谢负担和其他外源重组蛋白的引入可能会限制这些系统在某些应用中的吸引力，诸如基因疗法和生物制药生产。构建与宿主细胞的现有转录因子(TF)库相互作用的人工启动子消除了对辅助TF的需要，但是合成启动子-内源性TF-内源性启动子相互作用组(interactome)可能对合成和内源性启动子两者的活性动力学产生负面影响(2，3，15)。因此，使用当前可用的启动子构建方法，同时地优化启动子、表达盒和宿主细胞性能是具有挑战性的。这些相互关联的功能的并行优化只能通过计算机定制设计启动子(不需要互补的合成TF)来实现。实际上，面向遗传部件的从头合成设计是哺乳动物合成生物学的主要目标。

计算机启动子设计受到控制启动子活性的复杂规则的限制，这些规则包括复合TFRE的取向、空间定位和顺序，以及其同源TF的功能、表达水平和活性(16，17)。然而，Smith等人最近在成千上万的人工序列中系统性地测试了TFRE组织的规则，并发现启动子活性主要仅仅是相对TFRE拷贝数的函数(18)。这些发现支持TFRE组织的广告牌模型，其中在很大程度上可以忽略结合位点的间距、顺序和取向(19，20)。然而，在Smith等人(18)构建的启动子中，活性受到各个TFRE对之间的组合相互作用的影响。当复合TFRE能够进行协同和/或干扰相互作用时，TFRE相对顺序可能显著影响启动子活性，从而大大增加计算机启动子设计的复杂性。然而，研究已表明，TF之间的组合相互作用相对罕见(21)。而且，Smith等人仅在用于构建启动子的十二个TFRE中鉴定出八种(可能有六十六种)组合TFRE相互作用(18)。需要选择不协作作用的TFRE的方法，以便构建具有相对简单的设计规则的启动子。

发明内容