[发明专利]密封微孔测定法

说明书

本发明提供了用于在密封的小体积中进行微孔分析的方法、系统和试剂盒。本发明的微孔通过微孔和珠子几何形状的配对而被密封，其中珠子的直径大于微孔底部的直径。将珠子装入微孔中的一分析空间，该分析空间位于将样品密封在嵌套的珠子底部和目标微孔底部之间。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月21日提交的、序列号为62/474,283的临时申请的优先权，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于微孔分析的测定法。更具体地，本发明涉及密封微孔的测定法，用于分析小体积的生物样品。

背景技术

用于生物学测定的微孔阵列已经使用了一段时间。微孔阵列的应用之一是确定单个细胞的表达谱。例如，Fan等人的美国专利申请(公开号为：2016/0289669)公开了基于微孔的设备和系统，其用于单个细胞表达谱分析，其中在进行细胞生物学活性的分析之前，将单个细胞和单个配体包被(ligand-coated)的珠子装载到微孔中，并使沉淀物沉积在微孔的底部。但是，在执行分析时，微孔却保持在未密封的状态。

Fan等人的设备和系统，存在着许多缺陷。首先，微孔的未密封状态允许在微孔之间不受控制地交换目标生物分子，从而导致微孔存在交叉污染以及单个细胞分析的准确性受损。如Yuan和Sims(Scientific Reports 6，Article number：33883(2016))所示，此问题可以通过在微孔上覆盖一层与水不混溶的油来减轻，但这会使得测定变得更加复杂。如最近的出版物(Gierahn等人，Nat Methods.2017Apr；14(4)：395-398)中所描述的基于微孔的测定法，其试图通过使用半透膜来提供密封的微孔配置。但是，这种方法还需要在微孔技术的应用中增加步骤，从而使微孔分析变得复杂。其次，在微孔配置中，珠子(bead)和细胞彼此相邻放置，与细胞的体积相比，其中释放有细胞内容物的培养基的体积相对较大，导致被释放的生物分子的实质稀释，因此降低了与珠子上配体的结合效率。这种限制是基于半透膜的微孔密封方法所固有的。第三，当珠子和细胞在微孔底部彼此相邻放置时，很难将一个珠子与一个细胞精确地配对。第四，在阵列中，各个微孔内的珠子与细胞之间的距离通常不相同，从而导致目标生物分子与珠子之间的结合效率在各个微孔之间(microwell-to-microwell)发生额外的变化。因此，目前的基于微孔的测定法(包括用于单个细胞分析的基于微孔的测定法)的准确性、易用性和效率有待改善。

发明内容

本发明提供了用于增强基于微孔的测定法的准确性和效率的系统、方法、装置和试剂盒。本发明通过微孔和珠子的新型几何配对(geometric pairing)将样品封闭在微孔中的小体积内，从而提高了微孔分析的准确性和效率。这种几何配对具有许多优点。第一，密封样品防止相邻微孔之间的材料交叉污染。第二，通过微孔和珠子的几何配对将样品密封起来，可以减少用于携带样品的培养基的有效体积，从而提高样品的浓度，进而提高配体结合效率。第三，微孔和珠子的几何配对仅允许一个珠子进入微孔，从而防止了微孔中的细胞与一个以上的珠子配对的情况。最后，珠子相对于微孔中细胞的位置保持高度一致。

附图说明

图1示出了本发明的微孔的一些非限制性实施例的透视图；

图2示出了本发明的平截头体形微孔的一些非限制性实施例的透视图；

图3示出了本发明的多边形微孔的一些非限制性实施例的透视图；

图4示出了本发明的平截头体形多边微孔的一些非限制性实施例的透视图；

图5示出了本发明的微孔的非限制性实施例的尺寸；

图6示出了微孔和珠子的几何配对的非限制性实施例的透视图；

图7示出了微孔和珠子的几何配对的非限制性实施例的透视图；