[发明专利]具有分支结构的肺芽类器官的生成和其用于肺疾病建模的用途

说明书

本文描述了通过在3D基质中培养支化LBO或通过将所述LBO移植在免疫缺陷小鼠的肾包膜下由哺乳动物，优选人类多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(IPSC)制备肺芽类器官(LBO)的新方法，所述肺芽类器官能够发育成分支气道和肺泡结构，至少部分地重现人类肺发育。支化LBO含有与肺间充质相容的肺内胚层和中胚层，且经历支化形态发生。还描述了携带某些诱导纤维化表型的突变的LBO，以及其制备方法。突变的(B)LBO可用于筛选可以治疗肺纤维化的药剂。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月24日提交的美国临时申请序列号：62/476,335的优先权，该申请的内容并入本文。

政府利益声明

本发明是在政府资助下根据美国国立卫生研究院授予的授权号HL 134760进行。政府享有本发明的一定权利。

发明背景

特发性肺纤维化(IPF)是一种难以治疗的间质性肺病，中值存活期为3至4年，特征在于成纤维细胞灶以及肺泡的重塑和闭塞。^1,2唯一的确定性治疗是肺移植，即一种干预措施，受供体器官的低可用性，以及严重的手术、药物和免疫并发症困扰。³因此迫切需要创新方法。开发这类方法需要非常缺乏了解这种毁灭性且日益流行的疾病的发病机制并为药物发现建立平台。

附图说明

以举例的方式且不以限制的方式在图中说明本发明。

图1A-1E.生成肺芽类器官。(图1A)在第6天和第8天之间在AFE的腹侧化期间使粘附结构发育(参见方案图6b)，所述粘附结构可以在悬浮培养物中扩增(d10、d20)。代表>50次独立实验(ESC和iPSC)。比例尺250μm。(图1B)在生成LBO期间的细胞扩增。N＝RUES2 ESC的3次独立的一式三份实验。(图1C)EPCAM、KRT8、NKX2.1、FOXA1和P63在d25 LBO中的表达。代表>10次ESC和iPSC的独立实验。比例尺100μm。(图1D)针对ECADH和PDGFRA对d25 LBO的染色。代表3次RUES2 ESC的独立实验。比例尺250μm。(图1E)通过RNAseq测定的内胚层和中胚层标记物在d25 LBO的EPCAM⁺和EPCAM^-部分中的表达(3次独立的生物复制，RUES2 ESC)。

图2A-2G.LBO的体内潜能。(图2A)在将嵌入基质胶中的10⁶个LBO细胞移植到NSG小鼠的肾包膜下1.5个月后生长的宏观方面。比例尺1cm。(图2B)在移植1.5个月后LBO来源的生长的HE染色。比例尺500μm。(图2C)在移植1.5个月后在LBO来源的生长中指定标记物的免疫荧光。比例尺100μm。(图2D)在移植5个月后LBO来源的生长的HE染色。比例尺250μm。(图2E)在移植5个月后在LBO来源的生长中指定标记物的免疫荧光。比例尺250μm。(图2F)在移植5个月后，在LBO来源的生长的小管抽吸液中左侧标记的蛋白质的斑点印迹。(图2G)在移植7个月后，LBO来源的生长中指定标记物的HE染色和免疫荧光。比例尺100μm。所有组都使用RUES2 ESC，代表4次独立实验。

图3A-3B.第70天时基质胶中的LBO分化。(图3A)在涂铺到基质胶中之后，LBO发育成分支结构的明场成像。RUES2 ESC。代表>50次独立实验。比例尺500μm。(图3B)在第25天针对涂铺在基质胶中的d70 RUES2来源的LBO中指定标记物的免疫荧光染色。代表4次独立实验。比例尺250μm。