[发明专利]通用发夹引物

权利要求书

1.一种靶核酸扩增的方法，其包括：

(1)将第一靶核酸与下述物质混合：

(a)第一靶引物对，所述第一靶引物对包含一种或两种第一靶特异性发夹引物，所述发夹引物具有：

(i)3’单链靶特异性区，当其处于或低于Tm温度时，和

(ii)5’区，其在低于Tm温度时形成发夹而在高于Tm温度时不形成所述发夹，其中所述5’区包含通用衔接子序列，和

(b)通用引物对，所述通用引物对包含一种或两种通用发夹引物，所述通用发夹引物：

(i)具有所述5’区，并且

(ii)没有单链3'端，据在低于Tm温度时所确定；

(2)以处于或低于Tm温度的温度将来自所述第一靶引物对的至少一种第一靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区退火至所述第一靶核酸，并用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述靶特异性发夹引物，以形成包含一条或两条通用衔接子序列的第一扩增子；

(3)将所述第一扩增子变性成两条核酸链；

(4)以高于所述Tm温度的温度将所述一种或两种通用发夹引物退火至所述第一扩增子中一条链的通用衔接子序列；

(5)用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述一种或两种通用发夹引物，以形成第二扩增子，从而扩增所述第一靶核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一靶引物对包含两种靶特异性发夹引物或者所述通用引物对包含两种通用发夹引物。

3.如权利要求1所述的方法，其中，重复多次步骤(2)和(3)。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述第一靶引物对在步骤(4)之前耗尽。

5.如权利要求1所述的方法，其中，至少一种通用发夹引物与标签连接，从而使所述标签纳入所述第二扩增子，或者所述第一靶引物对不与标签连接。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述Tm温度比所述第一靶特异性发夹引物的Tm温度低至少2℃。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述混合进一步包括混合第二靶引物对，所述第二靶引物对包含一种或两种第二靶特异性发夹引物，所述第二发夹引物具有：

(i)3’单链靶特异性区，其不同于所述第一靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区，和

(ii)所述5’区；

步骤(2)包括以处于或低于Tm温度的温度将来自所述第二靶引物对的至少一种第二靶特异性发夹引物退火至第二靶核酸，并用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述第二靶特异性发夹引物，以形成包含一条或两条通用衔接子序列的第一延伸产物，

步骤(3)包括将所述第一延伸产物变性成两条核酸链；

(4)以高于所述Tm温度的温度将所述一种或两种通用发夹引物退火至所述第一延伸产物中一条链的通用衔接子序列；

(5)用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述一种或两种通用发夹引物，以形成第二延伸产物，从而扩增所述第二靶核酸。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述第二靶引物对包含两种靶特异性发夹引物或者所述一种或两种通用发夹引物包含两种通用发夹引物。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述混合还包括混合1-10、1-20、1-30、1-40或1-50种其他靶引物对，其中所述其他靶引物对包含一种或两种靶特异性发夹引物，所述靶特异性发夹引物具有：(i)3’单链靶特异性区，其不同于混合物中任何其他靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区，和(ii)所述5’区；其中对第一、第二和其他靶特异性发夹引物进行步骤(2)到(5)，从而扩增所述靶核酸。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸扩增在微滴中进行。