[发明专利]重启L-型细菌中合成噬菌体基因组

说明书

本发明涉及产生或繁殖工程化噬菌体的方法，包括以下步骤：提供能够感染靶细菌的工程化噬菌体的功能性合成基因组；提供受体细菌；在转化步骤中用所述功能性合成基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌；在第一孵育步骤中孵育所述转化的受体细菌，其中所述工程化噬菌体繁殖于所述转化的受体细菌内；和在第二孵育步骤中，用所述靶细菌进一步孵育所述转化的受体细菌或从所述转化的受体细菌中释放出的所述繁殖的工程化噬菌体，其中所述繁殖的工程化噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌内进一步繁殖，并且其中所述受体细菌是细胞壁缺陷型细菌。

技术领域

本发明涉及用于产生或繁殖噬菌体，具体而言工程化噬菌体的方法和装置(mean)。

背景技术

细菌噬菌体(Bacteriophage)噬菌体(phage))是专门感染细菌并构成其天敌的病毒。大多数噬菌体感染给定细菌物种菌株的特异性亚群而不会靶向其他密切相关的细菌。由于其特殊的特异性和溶菌潜力，噬菌体被用于各种生物医学和生物技术应用。一方面，它们被用作快速而灵敏检测活细菌病原体的诊断工具。另一方面，毒性噬菌体被用于特异性物种的生物控制，有效地从工业生产链和食品中去除潜在的病原体。此外，由于抗生素耐药性的增加，欧盟和美国(WHO和CDC)每年估计有48,000例死亡，噬菌体作为替代抗微生物剂的应用是一个受关注的重新兴起的领域，而噬菌体治疗方法表现出有前景的效果。考虑到传统抗生素的低发现率，并结合存在的公共卫生威胁抗药性细菌的日益增加，则假设噬菌体治疗的复兴将会继续是合理的。尽管噬菌体具有高属-和种-特异性、自复制性和低生产成本，但噬菌体面临着许多挑战，这些挑战仍然限制它们在生物医学环境中的应用：由于单独噬菌体的宿主范围受限，噬菌体混合物需要进行设计才能覆盖致病物种的所有医学相关菌株。一般获得噬菌体产品，具体而言噬菌体混合物的监管批准具有挑战性，并且监管框架尚不清楚。此外，溶原性(温和)噬菌体能够整合到所述宿主基因组中而不会诱导细胞裂解，并且甚至可以通过转导促进抗生素抗药性的传播或通过溶原转化增加细菌毒力，有效地排除了它们作为生物控制剂的用途。此外，靶细胞能够编码繁多的噬菌体抗药性机制，包括受体多样化、生物膜形成和CRISPR干扰等。通过修饰噬菌体的基因组，能够克服许多这些限制，并能够将其他有益特性包括于噬菌体基因组中。

不幸的是，毒性噬菌体的基因组工程化大都是困难的且工作密集型的过程。在大多数情况下，噬菌体基因组在感染期间通过与携带同源序列和所需遗传更改的质粒的同源重组进行修饰。因为噬菌体复制很快并且重组率通常非常低(10^-4～10^-10)，筛选重组噬菌体是劳动密集型的，并需要引入报告基因。最近，研究人员提出了一种修饰噬菌体基因组的精美合成方法：酵母人工染色体(YAC)和重叠噬菌体基因组片段在体内组装于酵母细胞中从而产生捕获于YAC中的完整重组基因组。随后，YAC-噬菌体DNA转化至大肠杆菌中以重启(reboot)这些噬菌体。到目前为止，该方法限于感染革兰氏阴性细胞并具有宿主非依赖性复制特征的T7家族病毒。相似的方法是否适用于不同的噬菌体家族和/或感染革兰氏阳性细胞的噬菌体，目前还是未知的。

因此，产生也适用于适合革兰氏阳性宿主的噬菌体的完整重组噬菌体基因组的简单有效方法，仍存需要。

发明内容

基于上述背景，本发明的目的是提供用于繁殖噬菌体，具体而言包括感染革兰氏阳性宿主细胞的噬菌体的简单有效方法和装置。

该目的通过根据权利要求1或权利要求10的方法和根据权利要求12的细胞壁缺陷型细菌而实现。

据此，本发明的第一方面涉及用于繁殖噬菌体，具体而言工程化的噬菌体的方法。该方法包括以下步骤：

-提供能够感染目标细菌的噬菌体的功能性基因组，

-提供受体细菌，

-在转化步骤中用功能性基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌，