[发明专利]重启L-型细菌中合成噬菌体基因组

权利要求书

1.一种产生或繁殖工程化噬菌体的方法，包括以下步骤：

-提供能够感染靶细菌的工程化噬菌体的功能性合成基因组，

-提供受体细菌，

-在转化步骤中用所述功能性合成基因组转化所述受体细菌，产生转化的受体细菌，

-在第一孵育步骤中孵育所述转化的受体细菌，其中所述工程化噬菌体繁殖于所述转化的受体细菌内，和

-在第二孵育步骤中，用靶细菌进一步孵育所述转化的受体细菌或从所述转化的受体细菌释放的繁殖的所述工程化噬菌体，其中繁殖的所述工程化噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌内进一步繁殖，

其中所述受体细菌是细胞壁缺陷型细菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受体细菌是革兰氏阳性细菌的或由其衍生的细胞壁缺陷型变体，具体而言是李斯特菌属(Listeria)细菌，具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的或由其衍生的细胞壁缺陷型变体。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶细菌是革兰氏阳性细菌，具体地选自李斯特菌属(Listeria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)或葡萄球菌属(Staphylococcus)，更具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、伊万诺维李斯特菌(Listeriaivanovii)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受体细菌和所述靶细菌属于或衍生自不同种或不同属的成员。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述功能性合成基因组通过其片段的体外或体内组装或通过从头合成法而提供。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述功能性合成基因组具有至少10,000个碱基对，具体而言至少30,000个碱基对，更具体而言至少40,000个碱基对的长度。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转化步骤在聚乙二醇，具体而言平均分子量范围为1,000g*mol^-1～30,000g*mol^-1，更具体而言7,000g*mol^-1～20,000g*mol^-1的聚乙二醇，具体而言PEG-8000存在下进行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一孵育步骤在范围为4～9h的时间段内，具体而言在范围为24～32h的时间段内进行实施。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受体细菌通过在细胞壁合成干扰抗生素，特别是选自β-内酰胺抗生素、糖肽抗生素、环丝氨酸、或磷霉素，和可选的渗透保护介质存在下孵育细胞带壁前体细菌而提供，产生所述受体细菌。

10.一种用于生产李斯特菌属细胞壁缺陷型细菌的方法，包括以下步骤：

-提供以基因型[Δlmo0584 Δlmo1653-54 Δlm01861]或不包含lmo0584、lmo1653-54和lmo01861的功能性同源物的基因组为特征的李斯特菌属细菌，具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌，更具体而言单核细胞增生性李斯特氏菌菌株EGD-e，或

-提供无害李斯特菌种的细菌，具体而言无害李斯特菌的菌株2021的细菌；和

-在细胞壁合成干扰抗生素存在下和可选地在渗透保护介质存在下培养所述细菌。