[发明专利]达贝泊汀组合物的制造方法和达贝泊汀产生细胞的培养方法

说明书

本发明的目的在于提供一种对达贝泊汀生产细胞进行培养而制造达贝泊汀组合物的方法，该达贝泊汀组合物的制造方法中，达贝泊汀组合物的总产量提高，并且提高由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀的一分子中的唾液酸含有率。本发明涉及一种达贝泊汀组合物的制造方法，其包括：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤1；和从通过步骤1得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤2。

技术领域

本发明涉及达贝泊汀组合物的制造方法和具有生产达贝泊汀的能力的动物细胞的培养方法等。

背景技术

近年来，正在积极进行使用动物细胞的基因重组蛋白质等有用物质的生产，为了得到最大的产生物产量，不仅要求增加该动物细胞的该蛋白质等的表达能力本身，还要求提高该动物细胞的增殖。

另一方面，即使基因重组技术在进步，仍然有难以生产的基因重组蛋白质，其中之一为糖蛋白。已知多数蛋白质以附加有糖链的糖蛋白的形式存在，其糖链结构的差异对蛋白质自身的功能产生很大影响。

对于应用基因重组技术的生物药品而言，通过将人的蛋白质的基因导入到动物细胞中来进行生产。但是，在使用动物细胞来生产糖蛋白的情况下，在由该生产细胞产生的唾液酸酶等糖链分解酶等的作用下，其糖链结构变得不均匀，因此有时无法显示出充分的药效。

已知作为造血因子的促红细胞生成素(EPO)具有3条N-连接型糖链和1条O-连接型糖链，血中半衰期随糖链末端的唾液酸数而变化，糖链末端的唾液酸数减少时，血中半衰期减少，几乎不显示生理活性(非专利文献1)。另外，发现了下述的达贝泊汀，其是为了进一步延长EPO的血中半衰期而改变了EPO的氨基酸序列的一部分、进而增加了唾液酸附加数而得到的(非专利文献2、专利文献1)。

达贝泊汀具有5条N-连接型糖链和1条O-连接型糖链，具有持续的红细胞增加作用，与现有的EPO制剂相比能够减少给药频率，能够减轻患者的负担。

但是，出于上述的原因，为了高效地生产与EPO相比具有更多的含唾液酸糖链的均匀的达贝泊汀，在提高产量的同时要求更高的糖链调控技术。

作为糖链调控方法，已知下述方法：为了抑制由分泌到培养液中的糖链分解酶所致的唾液酸从糖蛋白的脱离，将例如作为唾液酸酶抑制剂的2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(NeuAc2en)等低分子化合物添加到培养基中而进行培养。

另一方面，为了提高动物细胞的增殖和由该动物细胞产生的物质的产量，以往在对该动物细胞进行培养时使用的培养基中添加白蛋白、转铁蛋白或胰岛素之类的、血清或来源于血清的物质、来源于动物的蛋白质。向培养基中添加血清或来源于血清的物质、来源于动物的蛋白质时，存在细胞培养物和由其中得到的产生物质被肝炎、病毒或牛海绵状脑病(BSE)等污染的风险，因此，对不含有血清或来源于血清的物质和来源于动物的蛋白质的完全合成培养基(化学限定培养基，chemically defined medium)进行了开发。

作为典型的完全合成培养基的构成成分，可以列举氨基酸、有机盐或无机盐、维生素、矿物质、微量金属、糖、脂质和核酸等，已知通过在完全合成培养基中添加来源于大豆等植物的蛋白水解物，能够与含血清培养基同等程度地提高动物细胞的增殖和由该动物细胞得到的产生物质的产量(专利文献2、3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第2938572号说明书

专利文献2：国际公开第2001/023527号

专利文献3：国际公开第2006/045438号

非专利文献

非专利文献1：Glycoconjugate J.,1993；10；263