[发明专利]治疗性蛋白质对EV的改善加载

说明书

本发明涉及用各种类型的目的蛋白加载细胞外囊泡(EV)例如外来体的改进方法。更具体地，本发明涉及使用融合多肽构建体加载EV，以及融合构建体本身和携带这种融合多肽的EV。融合多肽的设计是实现有效表面展示和内部加载到目的蛋白的EV中的关键。

技术领域

本发明涉及用各种类型的目的蛋白质加载细胞外囊泡(EV)的改进方法。更具体地，本发明涉及使用包含多聚化结构域的融合构建体加载EV，以及融合构建体本身和携带这种融合构建体的EV。

背景技术

细胞外囊泡(EV)因其作为从小分子试剂和RNA治疗剂到抗体和其他蛋白质生物制剂的各种治疗方式的递送载体而越来越受到关注。借助于外来体递送基于多肽的试剂公开在开创性的专利申请WO2013/084000中，其描述了如何通过外源和内源加载技术将基于多肽的治疗剂加载到外来体中。外来体的外源加载在WO2013/084000中使用电穿孔或将目的多肽转染到从亲本细胞分离后的外来体中进行，而内源加载基于用编码目的多肽的构建体转染亲本细胞，然后过表达构建体并收获包含生物治疗性多肽的外来体。

另一个开创性的专利申请(WO2014/168548)公开了一种治疗性递送囊泡，如外来体，其具有连接到它们的膜的多肽构建体，该构建体包含至少一种载体多肽融合于至少一种治疗性多肽，其至少部分存在于囊泡的外部，使其显示在囊外环境中。其他专利申请已尝试使用外来体来递送蛋白质生物制剂，在WO2015/138878的情况下例如肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)。

特别地，WO2014/168548代表了亲本EV产生细胞的遗传修饰如何能够产生EV的优秀实例，其通常是外来体，展示了具有显著临床效用的治疗相关和基于高活性蛋白质多肽的生物制剂。在最近的两项研究(Yim等，Nature Communications，7：12277，2016和Lainscek等，BBRC，2017)中，作者展示了借助于光遗传异二聚化结构域，将两种独立的蛋白质构建体如何在外来体中二聚化。这两项研究代表了基因工程如何应用于在外来体中特异性二聚化两种蛋白质构建体的优秀实例，但两项研究都完全没有提及如何通过蛋白质工程可以改善单一类型多肽构建体的加载效率。因此，本领域仍有很大的空间进一步优化在亲本细胞的遗传修饰后在EV中或在EV上表达的目的蛋白质的数量，并且增加这种目的治疗性蛋白质的效力和/或亲和力和亲合力，用于靶向和治疗目的。

发明内容

为了克服本领域中的问题并且能够开发携带不同种类的目的蛋白的高效EV(通常是外来体)，本发明公开了包含至少一种目的蛋白(POI)、至少一种外来体分选结构域和至少一种多聚化结构域的复杂的融合多肽构建体。令人惊讶的是，本发明的设计产生了可以加载到EV中或加载到EV上的目的蛋白的更高数量级的密度，并且同样令人惊讶地，它还导致了EV产量增加和目的蛋白对其靶标的亲合力(即，例如诱饵受体对其靶分子的总亲和力或靶向配体对靶细胞或组织上的受体的总亲和力)增强。如上所述，Yim和Lainscek等人描述了两种单独的融合蛋白构建体的二聚化作为可溶性蛋白质加载到EV中的加载策略。然而，本发明代表了一种全新的方法，因为它使用多聚化结构域，特别是同源多聚化结构域，以增强单一类型融合多肽构建体的加载，即在单个多肽构建体中包含外来体蛋白、所述POI和所述多聚化结构域的一种类型融合蛋白的多个拷贝。重要的是，本发明因此解决了完全不同的问题，即不是可溶性蛋白质本身的加载，而是已经起加载目的蛋白作用和任选地表面展示目的蛋白的改善。

在第一方面，本发明涉及融合多肽，其包含至少一种POI、至少一种外来体分选结构域和至少一种多聚化结构域。在优选的实施方案中，本发明的多聚化结构域诱导单一类型的融合多肽构建体的同源多聚化为包含几种这样的多肽构建体的多聚体。已经在体外和体内评估和测试了各种多聚化结构域，表明该策略可以通过多核苷酸构建体的明智基因工程和编码融合多肽的载体广泛应用。