[发明专利]制备经不对称标签化的测序文库的方法

说明书

提供了用于制备经不对称标签化的测序文库的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括：获得cDNA或基因组DNA片段的经对称标签化的文库，将带尾的第一引物与所述文库的3'序列标签杂交并延伸其产生引物延伸产物，并使用带尾引物对扩增所述引物延伸产物以产生经不对称标签化的文库。

背景技术

许多下一代测序(NGS)平台需要经不对称标签化的片段，即侧翼为不同衔接子序列的DNA片段。衔接子序列对于流动细胞表面上的克隆扩增是必需的，并且还可以用作插入物或条码或样品索引序列的引发位点。例如，在Illumina的系统中，片段的一个末端是P5序列，另一个末端是P7序列。这些分子不能直接有效地生产，很大程度上是因为用于向片段添加衔接子序列的大多数方法以随机方式进行。如果以随机方式添加衔接子序列，则只有50％的经标记的片段被正确的序列不对称地标记(例如，片段在一个末端具有P5而在另一个末端具有P7)；另外50％的经标记的序列是经对称标记的(例如，片段在两个末端具有P5或在两个末端具有P7)。只有不对称片段适合在许多测序平台上进行测序。

当对单个细胞或少量细胞的基因组进行测序时，由衔接子附接的随机性引起的50％的覆盖损失是严重的问题。因此，需要制定新的策略。

发明内容

本公开内容尤其提供了用于从经对称标签化的测序文库制备经不对称标签化的测序文库的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括：获得cDNA或基因组DNA的片段的经对称标签化文库，将带尾的第一引物与所述文库的3'序列标签杂交并延伸其产生引物延伸产物，并使用先前的带尾引物扩增所述引物延伸产物以产生经不对称标签化的文库。

在一些实施方案中，所述方法可包括：(a)获得cDNA或基因组DNA片段的经对称标签化文库，其中所述文库的至少一些成员包含含有5'序列标签和3'序列标签的顶链，其中所述5'和3'序列标签具有互补序列；(b)使第一引物与所述文库的3'序列标签杂交，其中所述第一引物包含与所述文库的3'序列标签互补的3'区和5'非互补尾；(c)延伸所述第一引物以产生引物延伸产物，所述引物延伸产物从5'至3'包含所述第一引物的序列、片段的序列和(a)的5'序列标签的互补序列；以及(d)使用以下来扩增(c)的引物延伸产物：i.式A4-A3的正向引物，其中序列A4是5'尾，序列A3包含在所述第一引物的序列中；和ii.式A5-A2的反向引物，其中序列A5是5'尾，并且序列A2包含在(a)的5'序列标签中；以产生经不对称标签化的文库，其中至少一些成员包含顶链，所述顶链包含i.包含序列A5的第一末端，ii.片段的序列，和iii.包含序列A4的互补序列的第二末端。

在检查以下附图和详细描述后，本发明的其他组合物、系统、方法、特征和优点对于本领域技术人员将是清楚的或将变得清楚。据预期，所有此类附加的系统、方法、特征和优点都应包括在本说明书中，并且在本发明的范围内。

附图说明

技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本发明传授内容的范围。

图1的小图A和B示意性地示出了本方法的实施方案的一些原理。

图2示意性地说明了基于示例性转座酶的文库制备方法。

图3示意性地说明了使用分子条码的基于示例性转座酶的文库制备方法。

图4示意性地说明了基于示例性连接的文库制备方法。

图5示意性地说明了使用分子条码的基于示例性连接的文库制备方法。

图6示意性地说明了涉及加A尾的基于示例性连接的文库制备方法。该实验方案也适用于条码衔接子(见图5)。

图7示意性地说明了使用发夹寡核苷酸的基于示例性连接的文库制备方法。

图8示意性地说明了使用“V”寡核苷酸的基于示例性连接的文库制备方法。