[发明专利]一步发酵制备(R)-3-羟基丁酸或其盐

说明书

本发明涉及通过用非病原微生物一步发酵制备(R)‑3‑羟基丁酸或其盐的方法。(R)‑3‑羟基丁酸的发酵通过供应某些碳源和氮源来进行。这些微生物包括谷氨酸细菌HR057菌株或一种基因工程化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium Glutamicum)。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年4月4日提交的美国申请号62/481,476的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

发明技术领域

本发明属于生物工程领域，具体来说，涉及通过微生物发酵制备(R)-3-羟基丁酸及其盐的方法。

发明背景

(R)-3-羟基丁酸(3-HB)是CAS号为625-72-9的光学手性化合物。(R)-3-羟基丁酸是通过长链脂肪酸在哺乳动物肝脏中代谢产生的。它作为血浆和外周组织中的主要酮存在，并且可以在身体的大多数组织中用作能量来源。

(R)-3-羟基丁酸对治疗许多疾病有积极作用，并且也具有营养功能。例如，它可用于治疗由酮水平升高引起的许多疾病(如神经病症，包括癫痫和肌阵挛，以及神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病和痴呆)；它可通过氧化辅酶Q来减少自由基损伤(如缺血)；它可通过提高训练效率和运动表现，提高新陈代谢的效率，实现对支持不足(inadequatesupport)、心绞痛、心肌梗死等的治疗；它还可以用于治疗癌症相关疾病，如脑癌(星形细胞瘤等)。此外，它对葡萄糖代谢紊乱(如1型糖尿病、2型糖尿病、低血糖酮病等)的治疗具有良好效果。它可用于控制骨质减少(骨质减少)、骨质疏松症、严重骨质疏松症和相关骨折。基于这些功能以及治疗和营养作用，(R)-3-羟基丁酸及其盐可用作食品添加剂和药物，具有很大的健康和药用价值。

(R)-3-羟基丁酸主要通过化学方法制备。它可以由直接化学合成制得，或通过用聚-3-羟基丁酸解聚酶酶促降解聚-3-羟基丁酸酯制备。(R)-3-羟基丁酸的化学合成需要高温、高压和昂贵的手性金属催化剂。聚-3-羟基丁酸的酶促降解过程需要大量的有机溶剂和非常纯的聚-3-羟基丁酸酯作为起始原料。除反应时间长外，反应后难以控制产物的外消旋化。此外，由于成本高并且效率低，为了满足工业规模商业化的更高要求，该方法需要在实验室中进行更多优化。

目前，大多数市售3-羟基丁酸是外消旋混合物，其中(R)-3-羟基丁酸与(S)-3-羟基丁酸的比例约为1比1。尽管研究表明(S)-3-羟基丁酸不具有生理活性，但外消旋3-羟基丁酸及其盐(尤其是钠盐)仍然是主要的商品形式，并被大多数消费者所接受。预期单一的光学(R)-3-羟基丁酸及其盐在未来将变得流行，替代外消旋3-羟基丁酸及其盐。

通常，认为天然或生物化合物比化学生产的化合物更安全(和无毒)。人们更喜欢“天然”或“生物”特征的药物、食品和化妆品成分来源。出于市场目的，药物、食品和化妆品制造商更愿意用生物学方法代替化学方法来制造相同的产品。因此，目标是以生物学方法代替作为主要方法的化学方法来生产(R)-3-羟基丁酸。

发明简述

为了以生物学方法生产“安全且无毒”的(R)-3-羟基丁酸，发明人研究了各种生物学方法，并且出乎意料地发现以非病原微生物作为宿主的发酵程序能够以异常高效的一步法生产(R)-3-羟基丁酸。通过基因工程技术筛选和选择最佳工程化生物，以增强与(R)-3-羟基丁酸主要代谢途径相关的基因的表达，并削弱分支代谢途径。之后，在发酵过程中可有效积累(R)-3-羟基丁酸，其在工业规模上具有广阔的应用前景。

因此，一方面，本发明提供了一种高效生产(R)-3-羟基丁酸的生物学方法(例如，以一步法)。另一方面，本发明提供食品级(R)-3-羟基丁酸及其盐。又一方面，本发明还提供食品级外消旋3-羟基丁酸及其盐以满足市场需要。又一方面，本发明还提供了一种细菌，其可使发酵培养基发酵以产生(R)-3-羟基丁酸。