[发明专利]可变区序列文库构建方法、测序方法及其试剂盒有效
| 申请号： | 201880000622.0 | 申请日： | 2018-05-30 |
| 公开（公告）号： | CN109415768B | 公开（公告）日： | 2021-11-16 |
| 发明（设计）人： | 许林浩;黄智敏 | 申请（专利权）人： | 广州合谐医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6876 | 分类号： | C12Q1/6876;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 张春水;唐京桥 |
| 地址： | 510000 广东省广州市开发区广州*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 可变 序列 文库 构建 方法 及其 试剂盒 | ||
1.一种可变区序列文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、获得含有编码可变区的DNA样本；
步骤二、以所述DNA样本作为模板，通过第一引物群延伸编码所述可变区的DNA序列，获得第一扩增产物库，其中，所述第一引物群包括特异性识别J区的所有亚型的编码序列的第一引物，所述第一引物包括特异性识别J区的编码序列的核苷酸序列、校对随机段和第一接头，且所述特异性识别J区的编码序列的核苷酸序列、所述校对随机段和所述第一接头依次连接，所述第一引物群的校对随机段的序列互不相同；
步骤三、以所述第一扩增产物库作为模板，通过第二引物群和第一接头的引物扩增编码所述可变区的DNA序列，获得可变区序列组合产物，其中，所述第二引物群包括特异性识别V区的所有亚型的编码序列的的第二引物；所述第二引物包括特异性识别V区的编码序列的核苷酸序列和第二接头，且所述特异性识别V区的编码序列的核苷酸序列和所述第二接头相互连接；所述第一接头的引物包括特异性识别第一接头的核苷酸序列；
步骤四、以所述可变区序列组合产物为模板，通过第一测序接头和第二测序接头扩增编码所述可变区的DNA序列，获得可变区序列文库，其中，所述第一测序接头包括特异性识别所述第一接头的核苷酸序列和测序用接头，所述第二测序接头包括特异性识别所述第二接头的核苷酸序列和测序用接头，所述第一测序接头的核苷酸序列为SEQ ID NO：86所示，所述第二测序接头的核苷酸序列为SEQ ID NO：87所示；
所述编码可变区的DNA样本为T细胞受体的序列或B细胞受体的序列；
所述编码可变区的DNA样本为T细胞受体的序列，所述第一引物群的核苷酸序列如SEQID NO：1-13所示，所述第二引物群的核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：14-65所示；
所述编码可变区的DNA样本为B细胞受体的序列，所述第一引物群的核苷酸序列如SEQID NO：66-71 所示，所述第二引物群的核苷酸序列如SEQ ID NO：72-85所示。
2.根据权利要求1所述的可变区序列文库的构建方法，其特征在于，所述延伸具体包括：变性98℃，40s；延伸60℃，2 min；终延伸72℃，2 min；1个循环。
3.根据权利要求1所述的可变区序列文库的构建方法，其特征在于，所述步骤三的扩增为多重PCR。
4.根据权利要求3所述的可变区序列文库的构建方法，其特征在于，所述多重PCR具体包括：预变性95℃，15s；变性94℃，40s；退火60℃，4min；延伸72℃，90s；终延伸72℃，10s；35个循环。
5.根据权利要求1所述的可变区序列文库的构建方法，其特征在于，所述含有编码可变区的DNA样本为从动物外周血中提取的全基因组DNA。
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