[发明专利]一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

说明书

本发明建立了一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白tagRFP偶联于gp120蛋白羧基末端(C端)，构建真核表达载体，并制备gp120‑tagRFP融合蛋白；将人源CD4蛋白基因构建在CMV启动子下；将人源CCR5基因构建在CMV启动子下游，将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在NF‑κB RE‑TATA‑like人工复合调控元件的下游，两者构建于同一个慢病毒载体内；并建立新型的稳转细胞系CD4.CCR5.CCR5.NF‑κBR‑d2EGFP/Jurkat；以gp120‑tagRFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗CCR5药的效应，并可同时获得阻断功能与CC趋化因子/CCR5信号通路的生物学效应数据，构建了快速筛选抗CCR5药物和评估其生物学效应的实验模型。

技术领域

本发明涉及一种基于gp120/CCR5靶点及其生物效应的药物快速筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前已有几十种抗HIV-1药物得到美国食品与药品监督管理局(FDA)批准，其类型包括逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、CCR5受体抑制剂、整合酶抑制剂、以及融合抑制剂等。然而，已被批准的药物中没有一种是可以完全抑制病毒感染的，而且由于HIV-1突变株的产生，大部分均对不同类型的拮抗剂具有耐药性。此外，随着对病毒入侵过程的深入了解，研究者发现，大多数的HIV都是通过与CCR5或CXCR4结合来感染宿主细胞。通过病毒表面的包膜糖蛋白gp120与T细胞表面受体CD4和趋化因子受体CCR5或CXCR4相互作用进入宿主细胞，是人类免疫缺陷病毒(HIV)致病的关键。因而，辅助受体CCR5是目前抗HIV-1感染的首选靶点，CCR5拮抗剂做为抗HIV-1感染药物的研发成为热门。CCR5拮抗剂包括趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等4类。因此，建立一个高效、快速、简便、精确的高通量筛选系统非常重要，但目前为止尚未见有关报道。本发明在于建立一个基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的抗HIV-1感染药物的高效、快速、简便、精确的高通量筛选系统。

发明内容

本发明的目的是建立了一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法。

本发明构思如下：

采用红色荧光蛋白tagRFP偶联于gp120蛋白羧基末端，将该荧光蛋白标记基因构建载体并在细胞内表达，制备融合蛋自；将人源CD4基因克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；将人源CCR5基因构建在CMV启动子下，将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在NF-κB RE-TATA-like人工复合调控元件的下游，两者构建于同一个慢病毒载体内，获得高表达CCR5和调控表达报告基因质粒；二个基因共转染Jurkat细胞，建立稳转细胞系。将CCR5拮抗剂包括趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等新药与CD4.CCR5.NF-κ B RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后再与gp120-tagRFP荧光蛋白融合蛋白一起共孵育；同时设立稳转细胞与gp120-tagRFP荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组，清洗非特异性结合后检测荧光值。将CD4.CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat细胞与CC趋化因子试剂和筛到的具有gp120/CCR5阻断功能的CCR5拮抗剂共孵育为实验组；同时设立CD4.CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat细胞与CC趋化因子试剂共孵育为对照组，设立不做任何处理的CD4.CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat细胞为空白组，清洗非特异性结合后检测荧光值。通过检测红色荧光蛋白tagRFP荧光值判断该抗CCR5药是否具有gp120/CCR5阻断功能；通过检测绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值并与对照组比较，判断抗CCR5药是否影响CC趋化因子/CCR5的正常生物学效应。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：