[发明专利]一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

权利要求书

1.一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将第一荧光蛋白与HIV-1的gp120蛋白羧基末端连接构建重组gp120-第一荧光蛋白融合蛋白质粒；将gp120-tagRFP基因克隆至真核高表达载体CMV启动子下游，在第一荧光蛋白的C端连接6个组氨酸His标签；并转入细胞表达纯化，获得gp120-第一荧光蛋白融合蛋白；

2)将人全长CD4基因克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒CMV-CD4；将人全长CCR5基因克隆到CMV启动子下，同时将第二荧光蛋白基因构建在核因子κB应答元件NF-κBRE和TATA-like启动子人工复合调控元件的下游，两者构建于同一个慢病毒载体内，构建高表达CCR5和调控表达报告基因质粒CMV-CCR5.NF-κB RE-TATA-like-第二荧光蛋白质粒；将CMV-CCR5.NF-κB RE-TATA-like-第二荧光蛋白基因和CMV-CD4基因共转染到Jurkat细胞，建立稳转细胞系；

3)将待筛选的CCR5拮抗剂与稳转细胞共孵育后再与gp120-第一荧光蛋白融合蛋白一起共孵育；同时设立稳转细胞与gp120-第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；清洗非特异性结合；

4)检测第一荧光蛋白荧光值，并判断新药对gp120/CCR5具有阻断功能；

5)将稳转细胞与CC趋化因子试剂和上述4)筛到的具有gp120/CCR5阻断功能的CCR5拮抗剂共孵育为实验组；同时设立稳转细胞与CC趋化因子试剂共孵育为对照组，设立不做任何处理的稳转细胞为空白组；清洗非特异性结合；

6)检测第二荧光蛋白荧光值，并判断新药对CC趋化因子/CCR5信号通路的影响，筛选出对gp120/CCR5具有阻断功能但不影响CC趋化因子/CCR5信号通路的药物。

2.根据权利要求1的药物快速筛选方法，其中第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是绿色荧光蛋白d2EGFP。

3.根据权利要求2的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与gp120基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP接于gp120蛋白C端形成所述的gp120-tagRFP融合蛋白质粒，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。

4.根据权利要求3的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将gp120-tagRFP基因克隆至真核高表达载体转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达gp1203-tagRFP融合蛋白的gp120-tagRFP/293细胞系；扩增该gp120-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组gp120-tagRFP融合蛋白。

5.根据权利要求4的药物快速筛选方法，其中步骤2)中，人全长CD4基因克隆到真核表达载体CMV启动子下，获得质粒pCMV-CD4；将人全长CCR5基因克隆到CMV启动子下，同时将绿色荧光蛋白d2EGFP基因构建在核因子κB应答元件NF-κB RE和TATA-like启动子人工复合调控元件的下游，两者构建于同一个慢病毒载体内，构建新型的高表达CCR5和调控表达报告基因质粒pCMV-CCR5.NF-κB RE-TATA-like-d2EGFP；将pCMV-CD4、pCMV-CCR5.pNF-κB RE-TATA-like-d2EGFP分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-CD4和CMV-CCR5.pNF-κB RE-TATA-like-d2EGFP慢病毒，并共转染到Jurkat细胞，建立稳转细胞系CD4.CCR5.pNF-κB RE-TATA-like-d2EGFP/Jurkat；其中编码gp120-tagRFP融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，表达后gp120-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示；CCR5.NF-κB RE-TATA-Iike-d2EGFP的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示。