[发明专利]一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体

说明书

本发明公开了一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明通过菜豆来源的环氧水解酶1(PvEH1)进行饱和突变，获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶PvEH1 Z4X4‑59。PvEH1 Z4X4‑59对外消旋间氯环氧苯乙烷(rac‑mCSO)的最终ee_p，在25℃下从3.1％提高到92.3％，E值从2.6提高至26.5。

技术领域

本发明涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)能催化外消旋环氧化物的对映归一性水解，将底物完全转化为相应的单一构型，具有具有来源广、对映选择性和区域选择性较高、不需要辅助因子参与、反应条件温和、对环境友好等优点，环氧化物水解酶所介导的较为专一的立体选择性而逐渐走进人们的视野，被认为是一种极具工业应潜力的生物催化剂。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的EHs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，EHs对外消旋环氧化物的对映选择率E决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ee_s和ee_p。

手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理及毒性等方面的差异，使其在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。对映纯间氯环氧苯乙烷(mCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(mCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体。同时对映纯对氯环氧苯乙烷(pCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(pCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如R型对氯环氧苯乙烷((R)-pCSO)可以用于合成CB1拮抗剂；R型对氯苯乙二醇((R)-pCPED)是NMDA受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pCSO与pCPED的生物化学方法已经被报道。其中，Suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(R)-pCSO，其ee_p最高可达47％；Karboune等人利用来自重组黑曲霉(Aspergillus niger)的环氧化物水解酶(AnEH)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(R)-pCSO，当转化率达到51％时，ee_s为87％并保留S型底物；Manoj等人使用两种对映选择性互补的EH(StEH与AnEH)协同水解外消旋pCSO合成(R)-pCPED，ee_p达到93％。利用EHs催化制备(R)-pCSO与(R)-pCPED与席夫碱催化合成相比，具有ee_p高，来源清洁，更易分离等优势。

由于植物来源的EH更加容易获得且原料也较为廉价，引发了人们的研究兴趣。迄今报道的具有单一对映归一性催化特性的环氧化物水解酶有三种，分别来源于土豆、绿豆和新月柄杆菌。本实验室从菜豆(Phaseolus vulgaris)克隆了一种环氧化物水解酶(PvEH1)，并实现其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中异源表达。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。随着基因工程技术和高通量筛选技术的发展，对已知的环氧化物水解酶进行定向改造是丰富此类酶的重要途径。通过同源建模分析该酶的蛋白质结构，并通过定点突变技术对PvEH1进行分子改造，提高其对映归一性，将其更好的应用于工业生产。

发明内容