[发明专利]泽泻鲨烯环氧化酶及其应用

说明书

本发明公开了一种泽泻鲨烯环氧化酶及其应用，所述泽泻鲨烯环氧化酶具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明首次克隆了泽泻鲨烯环氧化酶基因全长，并提供了一种泽泻鲨烯环氧化酶，以及该酶基因的原核表达方法，并制得了该酶蛋白的多克隆抗体，提供了该蛋白的ELISA检测方法和Western Blot检测方法，本发明可用于提高泽泻原萜烷型三萜生物合成效率及监测药效成分动态积累过程。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及泽泻鲨烯环氧化酶及其应用。

背景技术

东方泽泻(Alisma orientale)为泽泻科属的一种植物，其主要药效成分为原萜烷型四环三萜类，该成分具有明显抗高血脂、降血压、抗HIV1等作用，尤其抗癌活性显著，其开发应用前景广阔，但其资源分布窄、含量低，仅存在于泽泻属等少数植物类群中，不能满足利用需求，生物工程是提高药效成分产量的有效途径之一。鲨烯环氧化酶(Squaleneepoxidase,SE)是原帖烷型三萜生物合成的关键酶，可用于研究提高原萜烷型三萜生物合成效率，以适应需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从东方泽泻(Alisma orientale)中获取的鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase)。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种泽泻鲨烯环氧化酶，具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

一种编码所述泽泻鲨烯环氧化酶的基因，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

所述泽泻鲨烯环氧化酶基因原核表达方法为：构建N端携带有His表达标签的重组表达载体；将重组载体质粒转化至BL21感受态细胞；IPTG诱导载体融合蛋白表达。

本发明还提供了所述泽泻鲨烯环氧化酶的多克隆抗体制备方法，通过原核表达纯化泽泻鲨烯环氧化酶并用免疫家兔制备多克隆抗体。具体为：取纯化蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行免疫印迹检测。

其中，所述纯化得多克隆抗体步骤为：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

通过ELISA检测纯化抗体的效价，步骤如下：

①用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜；

②次日每孔加入100μL5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH7.4的PBST洗涤3次；

③每孔加入500～51,200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液PBS，每份样品均做1平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；

④再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；

⑤每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2mol/L硫酸终止液；

⑥在酶标仪上测450nm下的OD值。

Western Blot检测步骤如下：