[发明专利]泽泻鲨烯环氧化酶及其应用

权利要求书

1.一种泽泻鲨烯环氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述泽泻鲨烯环氧化酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种泽泻鲨烯环氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.编码权利要求3所述泽泻鲨烯环氧化酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.权利要求2、4任一项所述基因的原核表达方法，其特征在于，构建N端携带有His表达标签的重组表达载体；将重组载体质粒转化至BL21感受态细胞；IPTG诱导载体融合蛋白表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述载体选用pCzn1质粒。

7.权利要求1、3任一项所述泽泻鲨烯环氧化酶的多克隆抗体制备方法，其特征在于，原核表达纯化泽泻鲨烯环氧化酶并用免疫家兔制备多克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，取纯化蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行免疫印迹检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化得多克隆抗体步骤为：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过ELISA检测纯化抗体的效价，步骤如下：

①用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜；

②次日每孔加入100μL 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH7.4的PBST洗涤3次；

③每孔加入500～51,200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液PBS，每份样品均做1平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；

④再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；

⑤每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2mol/L硫酸终止液；

⑥在酶标仪上测450nm下的OD值。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，Western Blot检测步骤如下：

①分别取200mg泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液，裂解液使用前加PMSF，匀浆器匀浆，充分裂解；取上清10μL加入等体积2X样品缓冲液，每个泳道上样20μL；

②上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；

③电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h；

④电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5min；然后置于5%m/V脱脂奶粉封闭液中封闭37℃，1h；

⑤用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h；

⑥洗膜4次，每次5min；用含5%牛奶的封闭液稀释二抗；膜在二抗中37℃反应1h；

⑦洗膜ECL显影。