[发明专利]检测母体外周血染色体异常的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测母体外周血染色体异常的引物、试剂盒及检测方法。所述引物包括扩增目标染色体上的基因对应的引物对。所述试剂盒包含前述的引物组合、探针组合、PCR反应液和Taq聚合酶。所述检测方法包括：采用液滴微反应器，使待检测的外周血样本的cfDNA与PCR反应液混合，并生成多重数字PCR反应液滴；利用前述试剂盒对液滴进行PCR扩增反应，并根据ALEXAFLUOR488信号的阳性位点数与HEX信号的阳性位点数的比值来确定目标染色体的倍数。本发明采用多重数字PCR技术，对8‑10周的孕妇即可进行超早期筛查、样本需求量少、只需要2mL的血浆样本、操作过程简单快速、检测周期短、且数据分析直观方便且成本低廉。

技术领域

本发明涉及医学和生物学技术领域，尤其涉及一种多重数字PCR技术检测母体外周血染色体异常的引物、探针、试剂盒，以及利用该试剂盒检测母体外周血染色体异常的方法。

背景技术

染色体非整倍体疾病是指常见的包括21－三体综合征(唐氏综合征或先天愚型)、18－三体综合征(爱德华氏综合征)、13－三体综合征(帕陶氏综合征)和X、Y性染色体非整倍体等，目前还没有治疗该染色体疾病的有效办法。产前筛查和产前诊断是当前优生的重要任务，同时也是防止染色体非整倍体胎儿出生的重要手段。随着孕妇血浆中游离胎儿脱氧核糖核酸(cfDNA)被发现，基因下一代高通量测序技术的快速发展，使cfDNA的分析技术促进了产前无创基因检测(NIPT)的良好发展。

随着NIPT(无创产前检测)技术的普及应用，越来越多的高风险和中等风险孕妇选择应用这种无创的产前DNA检测技术，进行胎儿唐氏综合征的筛查，而现在NIPT多采用高通量测序和信息分析技术实现，相对成本较高，且流程复杂，检测周期长。

数字PCR(digital PCR dPCR)是20世纪初发展起来的新型核酸分子定量技术，通过将微量DNA分子有限稀释并分液，使每个反应室平均含有一个或零个目标分子，所有反应室进行单分子扩增后通过分析荧光信号进行定量。由于其不依赖于扩增曲线的循环阈值(CT)，也不必采用内参基因和标准曲线，与常规定量PCR技术相比，具有更高的准确性、灵敏性及重复性，在肿瘤标记物早期检测、病毒载量检测等领域广泛应用。产前胎儿遗传学检测是预防出生缺陷的重要组成部分，传统的介入性产前诊断如绒毛穿刺、羊膜腔穿刺及脐静脉穿刺存在1％～3％的流产风险，且产前胎儿组织取材时不可避免混入母体组织，影响了胎儿遗传物质诊断的准确性；无创产前诊断虽可避免流产风险，但孕早期胎儿游离DNA(cfDNA)含量低，大量母体DNA的存在对核酸提取技术及检验技术提出较高要求，而数字PCR具有在大量背景分子中辨识少量目标分子的特点，应用于无创产前诊断，有操作简单、检测时间短、且成本低的优势。

目前，现有的应用于检测母体外周血中胎儿染色体唐氏筛查的产品主要是应用于NGS平台，依托NGS平台开发的染色体异常检测试剂盒存在的主要缺点是样本需求量多、一般需要4mL左右的血浆样本、操作过程冗长复杂、人员要求高、检测周期长、需要专门的数据分析人员且价格昂贵，整个检测过程需要几天的时间，且要求孕妇的妊娠时间在12周左右，应用具有较大局限性。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种检测母体外周血染色体异常的引物、探针，以克服现有技术中的不足。

本发明的另一主要目的在于提供一种检测母体外周血染色体异常的试剂盒。

本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒在检测母体外周血染色体异常中的用途。

本发明的另一目的还在于提供一种母体外周血染色体异常的检测方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种检测母体外周血染色体异常的引物组合，其包括扩增目标染色体上的基因对应的引物对，所述引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO.1～10所示。