[发明专利]控制猪只性别的育种方法、种公猪克隆细胞构建方法及应用

说明书

本发明提供了控制猪只性别的育种方法、种公猪克隆细胞构建方法及应用。控制猪只性别的育种方法，在含有Y染色体的猪只胚胎的性别分化期抑制其Sry基因表达，从而获得雌性性征的猪只。本技术方案通过在性别分化期抑制含有Y染色体的猪只胚胎的Sry基因表达，从而获得雌性性征的猪只，使得孕育的子代能够全部为雌性体征的猪只。该技术方案无需对种公猪采集所得的精液进行分离，而是直接控制受精卵使其不会向雄性体征进行分化，有效控制似样猪只的性状，免去饲养猪只过程中需要对公猪去势的烦恼。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对种公猪进行生育控制细胞系的构建方法，以及通过该构建方法获得的种公猪实现全雌子代的育种方法。

背景技术

公猪肉含有粪臭素和雄烯酮，公猪好斗难饲养，因此，须在小公猪时进行阉割，不利于集约化生产。国外为鲜肉上市，主要采用免疫去势。国内活猪出售，免疫去势后公猪尚存睾丸残迹，不好出售或售价较低。猪的性控精液生产存在着一系列的难题，包括：1.分离效率低(单位时间分离量)；2.猪精液冷冻保存技术不成熟；3.分离猪精液对稀释比和温度敏感；4.分离猪精受孕率低等等。猪性控精液不能获得产业上的推广应用，所面临的技术难题很多，主要是物种的特异性决定的，且短期内不能获得重大突破，因此业内目前尚无好的解决方案。

发明内容

基于现有技术在猪的性控精液存在难以突破的难题的情况，本技术方案提出利用转基因技术实现对猪的性别进行生育控制。

控制猪只性别的育种方法，在含有Y染色体的猪只胚胎的性别分化期抑制其Sry基因表达，从而获得雌性性征的猪只。

进一步，所述抑制Sry基因表达的方法为：利用Cre/LoxP重组酶系统对含有Y染色体的猪只胚胎中的Sry基因进行敲除。

进一步，所述敲除Sry基因的方法为：

(a1)对种公猪的细胞进行编辑，使该细胞的Sry基因的上、下游分别引入方向相同的LoxP序列，获得供体细胞；

(a2)以供体细胞进行克隆，获得基因重组种公猪；

(a3)采集基因重组种公猪的精液，进行人工授精，获得所述含有Y染色体的猪只胚胎；

(a4)对处于性别分化期的所述含有Y染色体的猪只胚胎添加Cre酶，敲除Sry基因。

又或者，所述敲除Sry基因可以通过另一种方法实现：

(b1)将含有LoxP位点的gRNA-Sry基因供体载体和Cas9mRNA共注射到受精猪卵子中；

(b2)培育步骤(b1)所得的受精卵，获得基因重组种公猪；

(b3)采集基因重组种公猪的精液，进行人工授精，获得所述含有Y染色体的猪只胚胎；

(b4)对处于性别分化期的所述含有Y染色体的猪只胚胎添加Cre酶，敲除Sry基因。

本申请文件同时提供了对应供体细胞进行克隆获得基因重组种公猪所需的种公猪克隆细胞的构建方法，其包括步骤：

(1)获取种公猪成纤维细胞，经接种培养后进行传代培养；

(2)将如SEQ ID №1所示序列片段与如SEQ ID №2所示序列片段分别接入含有Cas9载体中，分别获得可对Sry基因上游插入LoxP位点的打靶载体和可对Sry基因下游插入LoxP位点的打靶载体；

(3)取步骤(1)传代培养获得的成纤维细胞，将步骤(2)制得的打靶载体进行电转染，然后单克隆培养。

利用上述构建方法获得的种公猪克隆细胞可以用于培育Y染色体条件敲除Sry基因的种公猪的方法，具体包括以下步骤：