[发明专利]控制猪只性别的育种方法、种公猪克隆细胞构建方法及应用

权利要求书

1.控制猪只性别的育种方法，其特征在于，在含有Y染色体的猪只胚胎的性别分化期抑制其Sry基因表达，从而获得雌性性征的猪只。

2.根据权利要求1所述的控制猪只性别的育种方法，其特征在于，抑制Sry基因表达的方法为：利用Cre/LoxP重组酶系统对含有Y染色体的猪只胚胎中的Sry基因进行敲除。

3.根据权利要求2所述的控制猪只性别的育种方法，其特征在于，敲除Sry基因的方法为：

(a1)对种公猪的细胞进行编辑，使该细胞的Sry基因的上、下游分别引入方向相同的LoxP序列，获得供体细胞；

(a2)以供体细胞进行克隆，获得基因重组种公猪；

(a3)采集基因重组种公猪的精液，进行人工授精，获得所述含有Y染色体的猪只胚胎；

(a4)对处于性别分化期的所述含有Y染色体的猪只胚胎添加Cre酶，敲除Sry基因。

4.根据权利要求2所述的控制猪只性别的育种方法，其特征在于，敲除Sry基因的方法为：

(b1)将含有LoxP位点的gRNA-Sry基因供体载体和Cas9mRNA共注射到受精猪卵子中；

(b2)培育步骤(b1)所得的受精卵，获得基因重组种公猪；

(b3)采集基因重组种公猪的精液，进行人工授精，获得所述含有Y染色体的猪只胚胎；

(b4)对处于性别分化期的所述含有Y染色体的猪只胚胎添加Cre酶，敲除Sry基因。

5.种公猪克隆细胞构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取种公猪成纤维细胞，经接种培养后进行传代培养；

(2)将如SEQ ID№1所示序列片段与如SEQ ID№2所示序列片段分别接入含有Cas9载体中，分别获得可对Sry基因上游插入LoxP位点的打靶载体和可对Sry基因下游插入LoxP位点的打靶载体；

(3)取步骤(1)传代培养获得的成纤维细胞，将步骤(2)制得的打靶载体进行电转染，然后单克隆培养。

6.Y染色体条件敲除Sry基因的种公猪培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(Ⅰ)猪卵母细胞体外成熟：从母猪卵巢分离出胞质均匀、卵丘致密且包裹2层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体，洗涤后转入在培养箱中已经平衡2h以上的培养液内或四孔板中，用胚胎级矿物油覆盖，在39℃、5％的CO₂、95％空气、饱和湿度的条件下成熟培养42～44h；

(Ⅱ)脱卵丘：将培养成熟的卵丘细胞-卵母细胞复合体转移到含透明质酸酶的容器中，吹打2min后再转移到培养皿中，加入DPBS-PVA稀释，将脱去卵丘的卵母细胞拣出，洗涤后挑出带有第一极体的成熟卵母细胞，放到操作液滴中备用；

(Ⅲ)供体细胞准备：取得经权利要求5所述构建方法获得的克隆细胞，消化后离心洗涤，然后用操作液将其沉淀重悬；

(Ⅳ)卵母细胞去核与核移植：以盲吸法对脱卵丘后的成熟卵母细胞进行细胞去核，再将供体细胞从去核时裂口处放入卵周隙，用注射针点压透明带，使供体细胞与成熟卵母细胞的胞膜接触紧密，然后转移到培养液PZM3中，在39℃、5％的CO₂、100％湿度的环境下恢复1h，获得重构卵；

(Ⅴ)融合与激活：将恢复好的重构卵转移到融合液中平衡2min，用融合/激活液洗涤后，放入已经铺满融合液的融合槽内，以直流电脉冲诱导融合激活，接着用PZM3培养液洗涤，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中，39℃、5％的CO₂、100％湿度环境下培养4h；

(Ⅵ)胚胎培养：将融合的重构卵用胚胎培养液洗涤后，转入预平衡2h以上的胚胎培养液PZM3中，培养条件39℃、5％的CO₂、5％的O₂、90％的N₂、饱和湿度，获得克隆胚胎；

(Ⅶ)胚胎移植：将克隆胚胎缓慢的注射到自然发情的母猪的输卵管中。