[发明专利]烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法

权利要求书

1.一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将荧光碳点溶在超纯水中，使用荧光光谱仪扫描荧光碳点的3D荧光波谱，以确定荧光碳点的最大激发和发射波长，同时得到碳点的荧光峰型，使用透射电子显微镜观察荧光碳点的粒径分布；

B、胃蛋白酶酶活的测定是以血红蛋白为底物，以酪氨酸作对照，确定胃蛋白酶的活力单位，胰蛋白酶酶活的测定是以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯为底物，以不加荧光碳点为空白，确定胰蛋白酶的活力单位；

C、将NRK细胞接种在细胞培养基中培养，待NRK细胞生长至对数期时进行消化，消化后的NRK细胞悬液进行贴壁培养24 h，得到贴壁生长的NRK细胞；

D、将烤鲅鱼肉中荧光碳点分散在细胞培养基中，漩涡震荡，得到荧光碳点溶液；

E、将步骤D中的荧光碳点溶液梯度稀释成若干浓度，分别加入到步骤C得到的贴壁生长的NRK细胞中，培养24 h；

F、将培养后的NRK细胞在四氮唑蓝溶液中继续培养，向四氮唑蓝溶液培养后的NRK细胞中加入二甲基亚砜，在波长下测定吸光值，作为实验组结果，设置对照组，对照组的结果为将NRK细胞依次经细胞培养基、四氮唑蓝溶液和二甲基亚砜溶液处理后测得的吸光度值，将实验组结果和实验对照组结果代入公式计算得到细胞存活率；

G、用步骤F中得到的潜在危险浓度的烤鲅鱼肉荧光碳点溶液处理步骤C中消化后的对数期NRK细胞24 h，经胰酶消化后形成单细胞悬液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后离心，加入流式细胞缓冲液，测定细胞的生存情况，设置对照组，对照组的结果为将NRK细胞依次经细胞培养基、磷酸盐缓冲溶液和流式细胞缓冲溶液处理后测得的细胞生存情况，将实验组结果和实验对照组结果代入公式计算得到细胞凋亡率；

H、将实验鼠分为两组，对照组和实验组，将烤鲅鱼肉荧光碳点分散在超纯水中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液，小鼠口服的暴露，实验组小鼠口服荧光纳米粒子溶液，对照组小鼠口服NaCl水溶液，分别取对照组和实验组口服不同时间的小鼠主要器官观察荧光纳米粒子在小鼠器官中的积累情况。

2.根据权利要求1所述的一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于：所述步骤A中将荧光碳点溶在超纯水中，浓度为0.1-2 mg/mL，使用荧光光谱仪在Ex=300-450nm，Em=310-600 nm范围内扫描荧光碳点的3D荧光波谱。

3.根据权利要求1所述的一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于：所述步骤E中荧光碳点的浓度梯度为0-10 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于：所述步骤F中在492 nm波长下测定吸光值，作为实验组结果，荧光碳点的浓度为0-20 mg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于：所述步骤H中将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，分别在405 nm、458 nm和488 nm波段下激发。

6.根据权利要求1所述的一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于：所述步骤I中试验采用的是4-5周龄雄性小鼠，荧光纳米粒子的浓度为0-2 g kg^-1×小鼠体重（kg）/ 400 μL，分别取对照组和实验组口服0-24h的小鼠主要器官观察烤鲅鱼肉荧光碳点在小鼠器官中的积累情况。

7.根据权利要求1所述的一种烤鲅鱼过程中形成的荧光碳点的安全性评价方法，其特征在于：所述步骤I中小鼠主要器官包括肝、脑、肾、心和肠道，所述荧光碳点的浓度梯度为0-10 mg/mL。