[发明专利]一种κ-卡拉胶酶及其应用

说明书

本发明涉及一种具有热恢复特性的内切型κ‑卡拉胶酶CgkA及其应用。本发明提供的κ‑卡拉胶酶基因来源于海洋细菌Vibrio sp.SY08，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769。所述κ‑卡拉胶酶CgkA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。氨基酸序列与已知功能的κ‑卡拉胶酶相似度仅为87％。本发明所述的κ‑卡拉胶酶为重组表达工程菌株纯化所得，具有热恢复特性，酶液煮沸5分钟后，在冰水中(0℃)放置30分钟，可恢复其58.4％的活性。本发明所述的κ‑卡拉胶酶具有良好的理化性质，具备工业化应用潜质。

技术领域

本发明涉及一种具有热恢复特性的内切型新型κ-卡拉胶酶CgkA及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

卡拉胶是由1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。根据是否含有3,6-内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量的不同，目前工业上生产和使用的卡拉胶主要为κ-型、ι-型和λ-型三种，其二糖单元分别含有1个、2个和3个硫酸基。卡拉胶寡糖作为一种富含硫酸基的硫酸酯化糖类物质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、降血脂、免疫调节和抗凝血等生物活性。

卡拉胶降解酶是一种糖水解酶，通过断裂卡拉胶的β-1,4糖苷键将大分子卡拉胶降解为寡糖的酶。κ-卡拉胶酶是指专一性降解κ-卡拉胶的卡拉胶酶，传统的κ-卡拉胶酶是从海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然κ-卡拉胶酶产量低，发展基因工程的κ-卡拉胶酶势在必行。并且大多数报道的κ-卡拉胶酶热稳定和热恢复性较差，容易失活，无法达到工业化应用的要求。因此，寻找具有特殊性质的κ-卡拉胶酶具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有热恢复特性的内切型κ-卡拉胶酶CgkA及其应用。本发明提供的κ-卡拉胶酶基因来源于海洋细菌Vibrio sp.SY01，分类命名：弧菌SY01(Vibrio sp.SY01)，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769,保藏单位地址：武汉大学，保藏日期：2018年11月12日。本发明提供的κ-卡拉胶酶与已有κ-卡拉胶酶的氨基酸相似度仅为87％。最适反应温度为40℃；酶液煮沸5分钟后，在冰水中(0℃)放置30分钟，可恢复其58.4％的活性。该酶降解方式为内切，酶解主产物为κ-卡拉胶二糖和四糖。

一方面，本发明提供一种新型κ-卡拉胶酶CgkA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MLGTPSLARSQSGDNAKPLTAKPGEKWTIKWNRSDDFDGDLVDWKKWNFQTENYGVWSWRNENATVSNGKLKLTTKRETHNRTFWDGCNQQQVANYPLYYTSGVAKSRATGNYGYYEARIKGASTFPGVSPAFWMYSTIDRSLTKEGDVQYSEIDVVELTQKSAVRESDHDLHNIVVKNGKPTWMRPGSFPQTNHNGYHLPFDPRNDFHTYGVNVTKDDITWYVDGVQVGYKKNLYWHRQMNLTLSQGLRAPHTEWRCNQFYPSANKSAEGFPTSMEVDYVRTWVKVGNNNSDPGEGQSCPNTFVAVNSVQLSAAKQTLRKGQSTTLNTNVLPACATNKNVVYSTSNKNVATVTNEGVVKAKNKGSATITVKTKNKGKTDTVMITVN

另一方面，本发明还提供一种κ-卡拉胶酶CgkA对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：