[发明专利]一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法

权利要求书

1.一种猪伪狂犬病重组病毒株，其特征在于：所述重组病毒株为rPRV-gE^-/TK^-/GP5⁺/M⁺、rPRV-gE^-/TK^-/GP5⁺/M⁺/IL-18⁺、rPRV-gE^-/TK^-/GP5m⁺、rPRV-gE^-/TK^-/GP5m⁺/IL-18⁺ 或rPRV-gE^-/TK^-/IL-18⁺，其中GP5m是指修饰型GP5。

2.一种如权利要求1所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法，其特征在于：

（1）、设计PCR扩增GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18、表达框的引物，分别为：

G-GP5m F：如SEQ ID No.1所示；G-GP5m R：如SEQ ID No.2所示；

D-GP5m F：如SEQ ID No.3所示；D-GP5m R：如SEQ ID No.4所示；

G-2A-M F：如SEQ ID No.5所示；G-2A-M R：如SEQ ID No.6所示；

D-2A-M F：如SEQ ID No.7所示；D-2A-M R：如SEQ ID No.8所示；

2A-IL-18 F：如SEQ ID No.9所示；2A-IL-18 R：如SEQ ID No.10所示；

GP5 F：如SEQ ID No.11所示；GP5 R：如SEQ ID No.12所示；

IL-18 F：如SEQ ID No.13所示；IL-18 R：如SEQ ID No.14所示；

CMV F：如SEQ ID No.15所示；Poly R：如SEQ ID No.16所示；

其中：G-GP5m F和G-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的GP5m序列扩增；D-GP5m F和D-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m的GP5m序列扩增；G-2A-M F和G-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的2A-M序列扩增；D-2A-M F和D-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M的2A-M序列扩增；2A-IL-18 F和2A-IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5m-2A-IL-18的2A-IL-18序列扩增；GP5 F和GP5 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5-2A-M的GP5序列扩增；IL-18 F和IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-IL-18的IL-18序列扩增；CMV F、PolyA R用于扩增含有CMV、外源性基因、PolyA的完整表达框；其中，G-GP5m不含GP5m基因的终止密码子，D-GP5m含GP5m基因的终止密码子，G-2A-M含有2A肽序列但不含M基因的终止密码子，D-2A-M含有2A肽序列和M基因的终止密码子，2A-IL-18含有2A肽序列和IL-18基因的终止密码子，GP5不含GP5基因的终止密码子，IL-18含IL-18基因的终止密码子；

（2）、外源性基因GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的RT-PCR扩增

从PRRSV ATCC-VR2332中提取RNA，采用引物Random进行RT反应；以RT反应的产物cDNA为模板，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增外源性基因，扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳并回收外源性基因片段，备用；

（3）、重组质粒pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-IL-18的构建

（3.1）pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的构建：

（3.1.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和Sph I双酶切G-2A-M，EcoR I和Sph I双酶pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；

（3.1.2）EcoR I和Sph I双酶切pMD-GP5-2A-M，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M、2A-IL-18和pZJ-1，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18；

（3.2）pZJ-GP5-2A-M的构建：

（3.2.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和BamH I双酶切D-2A-M，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；

（3.2.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5-2A-M，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pZJ-1，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M；

（3.3）pZJ-GP5m-2A-IL-18的构建：

（3.3.1）EcoR I和Sph I双酶切G-GP5m，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m、2A-IL-18和pMD18-T，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m-2A-IL-18；

（3.3.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m-2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pZJ-1，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m-2A-IL-18；

（3.4）pZJ-GP5m的构建：

（3.4.1）EcoR I和BamH I双酶切D-GP5m，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m和pMD18-T，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m；

（3.4.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m和pZJ-1载体，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m；

（3.5）pZJ-IL-18的构建：

（3.5.1）EcoR I和BamH I双酶切IL-18，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的IL-18和pMD18-T，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-IL-18；

（3.5.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的IL-18和pZJ-1，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-IL-18。

（4）、穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18的构建

分别以重组质粒pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18或pZJ-IL-18的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的基因片段和pTK，T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒依次命名为pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18；

（5）、在穿梭载体上下游同源臂上重新设计引物：上游引物如SEQ ID No.17所示，下游引物如SEQ ID No.18所示；然后分别以已构建好的穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18或pTK-IL-18为模板，PCR扩增同源重组的基因片段，回收基因片段，分别获得TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18；

（6）、PRV缺失株rPRV-gE^-/TK^-/EGFP⁺基因组的提取

蛋白酶K法提取PRV缺失株rPRV-gE^-/TK^-/EGFP⁺的基因组DNA，溶于无菌TE，测定浓度后，保存备用；

（7）、重组病毒株的构建

将rPRV-gE^-/TK^-/EGFP⁺基因组分别与基因片段TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18共转染至293T细胞，蚀斑纯化，依次获得rPRV-gE^-/TK^-/GP5m⁺、rPRV-gE^-/TK^-/GP5m⁺/IL-18⁺ 、rPRV-gE^-/TK^-/GP5⁺/M⁺、rPRV-gE^-/TK^-/GP5⁺/M⁺/IL-18⁺、rPRV-gE^-/TK^-/IL-18⁺。