[发明专利]人体组织/细胞标本环状RNA的内参基因hsa_circ_0000284及其应用

说明书

本发明公开了一种人体组织/细胞标本环状RNA的荧光定量PCR（RT‑qPCR）内参基因hsa_circ_0000284及其引物和应用。本发明首先在高通量测序结果中筛选，然后利用RT‑qPCR在人体各种细胞中验证，证实所得到的内参基因及其特异性引物用于人体相对表达分析的准确性和稳定性，并且其表达水平不受化疗药物、缺氧等实验条件的影响。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人体组织/细胞标本环状RNA的RT-qPCR内参基因hsa_circ_0000284及其引物和应用。

背景技术

环状RNA(circular RNAs，circRNAs)是一类以共价键形成的单链闭合环形结构的分子，没有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，结构相对稳定，不受核糖核酸酶R(RNase R)的影响。1976年人类就已经发现环状RNA分子的存在，但一直被视为是错误的剪切产物，或是逃脱内含子套索脱枝的中介物。近年来，随着高通量测序技术的发展和分析方法的更新，大量的环状RNA分子被鉴定出来。越来越多的研究表明环状RNA分子并不是基因剪切副产物，而是具有一定功能的分子，主要功能包括竞争性吸附miRNA、结合蛋白而影响蛋白的功能、翻译成蛋白、竞争mRNA的线性剪切、调控RNA聚合酶Ⅱ活性、以及作为疾病的生物标志物。

RT-qPCR作为一种检测RNA的敏感方法已被广泛应用于基因的表达分析。在利用RT-qPCR技术检测目的基因的表达水平时，为了减少检测样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差异，需要内参基因进行标准化和校正。内参基因在很大程度上决定了RT-qPCR结果的准确性，所以找到可以在所有样本和实验条件下稳定表达的基因作为内参基因是RT-qPCR技术正确实施的关键。

目前，在检测环状RNA表达水平时，研究人员仍使用线性的β-actin或GAPDH作为内参基因。由于环状RNA和其亲本线性基因有相同的序列，为了防止亲本线性基因的干扰，需要为环状RNA设计背靠背引物(divergent primer)。虽然背靠背引物在一定程度上排除了亲本线性基因的干扰，但是无法排除与环状RNA有相同接头(back-splice junction)序列的线性剪切异构体的干扰。最佳的做法是用RNase R来去除这些线性剪切异构体的干扰，然而这也会去除作为内参基因的β-actin或GAPDH，所以无法再使用这些线性内参基因来校正目的基因的表达。而将RNA等分为二，一份用RNase R处理用于环状RNA的扩增，另外一份用于内参基因的扩增，再进行校正的做法会受RNase R缓冲液中Mg²⁺的干扰。因此，在环状RNA的研究领域迫切需要开发能够作为环状RNA标准化的内参基因。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种人体组织/细胞标本环状RNA的RT-qPCR内参基因hsa_circ_0000284及其引物和应用，该内参基因hsa_circ_0000284本身也是环状RNA，可耐受RNase R的处理，克服了现有技术环状RNA检测中RNase R处理后无内参的难题。

本发明的第一个目的是提供人体组织/细胞标本环状RNA的RT-qPCR内参基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供上述人体组织/细胞标本环状RNA的RT-qPCR内参基因hsa_circ_0000284的特异性引物，其正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

本发明的第三个目的是提供上述内参基因或特异性引物在制备RT-qPCR试剂盒中的应用。

进一步地，所述试剂盒还包括常规PCR试剂。

上述内参基因hsa_circ_0000284作为人体组织/细胞标本环状RNA的RT-qPCR内参基因的应用。

上述特异性引物作为人体组织/细胞标本环状RNA的RT-qPCR特异性引物的应用。