[发明专利]一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法在审
申请号: | 201811566564.6 | 申请日: | 2018-12-19 |
公开(公告)号: | CN109554395A | 公开(公告)日: | 2019-04-02 |
发明(设计)人: | 宁志丰;刘复兴;吴基良;武倩 | 申请(专利权)人: | 湖北科技学院 |
主分类号: | C12N15/869 | 分类号: | C12N15/869;C12N7/01;A61P35/00;C12R1/93 |
代理公司: | 武汉荆楚联合知识产权代理有限公司 42215 | 代理人: | 喻志勇 |
地址: | 437100 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 前列腺癌细胞 溶瘤病毒 构建 表达序列 基因组 启动子 剔除 前列腺癌 免疫调节作用 特异性启动子 免疫细胞 正常组织 繁殖 病毒 受损 细胞 感染 | ||
1.一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、构建pdICP4-promoter质粒:PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后,用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株,并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来,并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter;
步骤二、构建pdICP4-PSA-promoter质粒:用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人PSA启动子序列从质粒pcDNA3.1-PSA-promoter中释放出来,用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处,从而构建质粒pdICP4-PSA-promoter;
步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株:将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-PSA-promoter共同转染BHK细胞,使这两者在BHK细胞发生同源重组,获得表达PSA启动子的重组病毒载体17-d4-PSA-promoter;
步骤四、构建pdICP34.5质粒:PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列,得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接,随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中,用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端,得到的质粒命名为pdICP34.5;
步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12:用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-PSA-promoter中的PSA-promoter,产生质粒pcDNA3.1-hIL-12;把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处,创建质粒pdICP34.5-hIL-12;
步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-PSA-promoter中ICP34.5基因,从而构建出溶瘤病毒HSVPSA+IL-12。
2.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,步骤一中的ICP4启动子中,
上游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP4-promoterUSf为AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC;
下游序列ICP4-promoterUSr为AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT;
下游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP4-promoterDSf为AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC;
下游序列ICP4-promoterDSr为AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。
3.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,步骤四中的ICP34.5基因中,
上游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP34.5USf为CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG;
下游序列ICP34.5USr为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG;
下游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP34.5DSf为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA;
下游序列ICP34.5DSr为TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。
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- 吴艳涛;郦晓琼;张小荣;徐晓静 - 扬州大学
- 2007-10-25 - 2009-11-11 - C12N15/869
- 本发明涉及家禽用禽流感和马立克氏病二联活疫苗rMDV-HA病毒株及构建方法。本发明采用反转录-聚合酶链反应或聚合酶链反应扩增H5亚型禽流感病毒SY株血凝素基因、网状内皮增生症病毒LTR、筛选标志基因lac/smGFP和马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗株基因组外源基因并将其克隆到质粒载体中,得到重组质粒pHA、pLTR、ploxP-lac/smGFP-loxP、pUP和pDOWN,将转移载体pMHA质粒DNA与从马立克氏病毒Rispens CVI 988疫苗株感染细胞提取的DNA共转染鸡胚成纤维细胞,同源重组将外源基因插入到马立克氏病毒RispensCVI 988疫苗株基因组,得到带筛选标志基因的重组病毒rMDV-HA/GFP;由cre酶介导的loxP位点间序列重组去除rMDV-HA/GFP的筛选标志基因lac/smGFP,纯化后得到rMDV-HA病毒株。成本低、无污染、免疫期长,可作为禽流感和马立克氏病二联活疫苗病毒株。
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