[发明专利]可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法。所述载体通过分别构建细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a‑ΔspMBP‑bR‑ApoAI*‑His和高度折叠的绿色荧光蛋白表达载体pET28a(+)‑sfGFP载体，经酶切将bR‑ApoAI*‑His整合到pET28a(+)‑sfGFP载体中，得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体pET28a(+)‑sfGFP‑bR‑ApoAI*‑His载体。本发明构建的融合表达载体能够实现细菌视紫红质的水可溶性和可视化表达，并且表达量较高。

技术领域

本发明属于基因载体制备技术领域，涉及一种可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法。

背景技术

微生物视紫红质(Microbial Rhodopsin)是原核生物和低等真核生物中普遍存在的光感受器，其中以古细菌视紫红质(Bactiorhodopsin，bR)为代表。bR是古细菌中的质子泵，主要负责捕获光能并利用此能量实现质子的跨细胞膜运输。当其配体，也就是视黄醇分子(Retinol)，吸收一个光子从反式变为顺式结构时，将导致视紫红质蛋白质发生构象变化并籍此实现质子的跨膜运输。然而由于视紫红质是一类由七个跨膜螺旋组成的整合膜蛋白，它的结构功能的研究受阻于其水不溶性以及来自表面活性剂的干扰，尤其是光化学循环中视紫红质蛋白质的构象变化细节及一系列中间态信息还有待深入研究。

但是从生物组织中提取的细菌视紫红质量非常少，若要达到一定的剂量，研究成本很高。文献1(POMPEJUS M,et al.High-yield production of bacteriorhodopsin viaexpression of a synthetic gene in Escherichia coli[J].The FEBS Journal,1993,211(1-2):27-35.)，在大肠杆菌中表达的细菌视紫红质以包涵体形式存在，其天然构象被破坏，而且表达量不高。因此需要寻找细菌视紫红质大量表达的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法。该载体以pET28a(+)质粒作为骨架，在细菌视紫红质N端连接了高度折叠的绿色荧光蛋白sfGFP，在细菌视紫红质C端连接截短的人载脂蛋白ApoAI*包裹细菌视紫红质的脂溶性表面，使bR蛋白实现水溶性，且能使bR蛋白表达可视化。

实现本发明的目的的技术方案如下：

可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体，利用PCR扩增pET19b-sfGFP质粒，得到sfGFP，将sfGFP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-sfGFP载体；PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，将ΔspMBP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；PCR扩增pET28a(+)-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a(+)-ΔspMBP载体中得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增密码子优化过的细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)合成基因，将其整合到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His；酶切pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，得到bR-ApoAI*-His，将bR-ApoAI*-His整合到pET28a(+)-sfGFP载体中得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

本发明进一步提供上述可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤1，pET28a(+)-sfGFP载体的构建：