[发明专利]可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法

权利要求书

1.可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体，其特征在于，利用PCR扩增pET19b-sfGFP质粒，得到sfGFP，将sfGFP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-sfGFP载体；PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，将ΔspMBP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；PCR扩增pET28a(+)-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a(+)-ΔspMBP载体中得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增密码子优化过的细菌视紫红质合成基因，将其整合到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His；酶切ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，得到bR-ApoAI*-His，将bR-ApoAI*-His整合到pET28a(+)-sfGFP载体中得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

2.根据权利要求1所述的可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，pET28a(+)-sfGFP载体的构建：

先将pET19b-sfGFP质粒进行PCR后得到sfGFP片段，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对sfGFP和pET28a(+)质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-sfGFP载体；

步骤2，pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体的构建：

步骤2.1，先将pMBP-p质粒进行PCR扩增，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔspMBP和pET28a(+)质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；

步骤2.2，将pET28a(+)-ApoAI质粒进行PCR扩增，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a(+)-ΔspMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a(+)本身所带的His标签，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；

步骤2.3，将密码子优化过的细菌视紫红质DNA进行PCR扩增，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对细菌视紫红质DNA和pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体；

步骤3，pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体的构建：

用PstⅠ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His和pET28a(+)-sfGFP质粒进行酶切，连接反应得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2.3中，所述的优化为将原有序列中的对于大肠杆菌K-12菌株而言的稀有密码子和不利于蛋白翻译的碱基替换成易于在宿主菌中翻译表达的碱基。

4.根据权利要求1所述的可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的表达方法，其特征在于，具体步骤如下：将可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达，收集菌液，离心得到表达融合了高度折叠的绿色荧光蛋白sfGFP的细菌视紫红质的菌体。

5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，所述的诱导表达过程中，采用异丙基硫代半乳糖苷为诱导物。

6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述的诱导时间为1h。