[发明专利]一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其应用

说明书

本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其应用。本发明利用基因工程技术将抗CD24人源化嵌合抗体cG7与具有募集和激活NK细胞活性的MICA分子通过柔性肽(Gly₄Ser)连接，稳转于CHO‑s真核表达体系，挑取稳定高表达细胞株扩大培养表达cG7‑MICA；双特异性抗体cG7‑MICA利用cG7的靶向作用可以重塑MICA的功能将MICA选择性地展示在CD24⁺肿瘤细胞表面，诱导NK细胞的免疫监视作用，并通过其Fc段的作用进一步激活NK细胞，发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；通过实验验证，在体内外都具有杀伤CD24⁺肝癌细胞的免疫活性。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可同时与白细胞分化抗原CD24(cluster of differentiation 24)和自然杀伤细胞(natural killer cells；NK cells)表面上活化型受体NKG2D(NK cell receptor NK group 2，member D)特异性结合的抗CD24人源化嵌合抗体融合人源MICA分子的双特异性抗体cG7-MICA，其利用cG7的靶向作用可以重塑MICA的功能将MICA选择性地展示在肝癌细胞表面，募集并激活NK细胞发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity；ADCC)。在CD24⁺人源肝癌细胞Huh-7皮下荷瘤小鼠模型中，可有效抑制肿瘤组织的生长。cG7-MICA的设计可以避免肿瘤组织中MICA分子的脱落导致的肿瘤免疫逃逸，并且具备Fc段引导的ADCC作用，是一种具有靶向CD24分子和增强NK细胞功能的双特异性基因工程抗体。

背景技术

肿瘤的治疗一直是我们面对的棘手的难题，由于化疗和手术治疗对机体损伤大、预后差，肿瘤免疫疗法成为当代肿瘤治疗的热点。肿瘤免疫治疗旨在重塑机体自身免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤能力，利用抗体与抗原或者配体与受体的特异性结合的导向性将机体天然存在的免疫细胞募集到肿瘤病灶部位，利用免疫细胞发挥杀伤肿瘤细胞的活性。因此，寻找有效的分子靶标将为实现特异性的肿瘤免疫治疗提供可能性。

(一)肝癌与肿瘤相关性抗原CD24分子。

肝癌(Hepatocellular carcinoma；HCC)是最普遍的原发性肿瘤，并影响着世界上许多人的健康。它被列为全球第五大常见的癌症并成为第二大导致癌症死亡的原因。HCC相对于其他人类实体恶性肿瘤具有高侵袭性和转移力的特点，因此给肝癌的治疗增加了难度。在治疗肝癌上已经投入了很多的努力，但都由于一些不良反应，许多用于治疗晚期HCC的临床药物已被放弃。单一治疗药物，而包括贝伐单抗(Avastin)和西妥昔单抗(Cetuximab)在内的治疗性抗体也都显示出有限的抗HCC活性。

肿瘤相关性抗原CD24分子是一种高度糖基化的膜蛋白，在多种肿瘤细胞上表达，CD24在原发性肝癌组织中有高表达概率。并且在原发性肝癌组织中CD24的表达显著高于肿瘤临近组织和正常的肝组织。在肿瘤细胞中，CD24通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜上的脂筏结构。该结构是Src家族酪氨酸激酶信号途径的重要平台。CD24与Src相互作用并增强Src激酶活性，进而使STAT3分子(signal transducers and activators oftranscription)形成活化态；活化的STAT3形成二聚体进入细胞核内，发挥转录因子的作用。说明CD24的表达与肿瘤细胞的分化、侵袭、转移和肿瘤的复发等密切相关。这些都显示CD24分子可以作为肿瘤细胞的特异性标记分子，可以用作为肝癌治疗的分子靶标。

(二)肿瘤免疫逃逸与MICA/NKG2D信号通路。