[发明专利]一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有融合蛋白、缓存液1、酶底物、缓存液2、阴性对照品、阳性对照品与96孔板。

2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白由以下方法制备：选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列HER2抗原基因序列、MUC1抗原基因序列，进行PCR扩增，在kpnl位点GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；

根据HER2基因序列Genebank：NC_000017.11设计引物，

正向引物5′CGGGGTACCCCGATGCCCCGG3′，

反向引物5′TGCTCTAGATCACACTGG3′，以健康人血清为模板，PCR扩增基因；

根据MUC1基因序列Genebank：NC_000001.11设计引物，

正向引物5′CGGGGTACCCCGATGACACCG3′，

反向引物5′TGCTCTAGACTACAAGTT3′，以健康人血清为模板，PCR扩增基因；

将获得的目的片段与PA0815载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；

质粒转化与扩繁提取：

将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，提取重组质粒；

融合蛋白的获取：

将293改良细胞复苏后37℃，5％二氧化碳培养箱，DMEM培养基培养40-60h，进行细胞传代继续培养40-60h后使用重组质粒进行细胞转染实验，继续在相同条件下培养48h后，使用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS缓冲液收集细胞；

重组融合蛋白的纯化：

将收集的细胞用硫酸铵沉淀法进行分级沉淀，沉淀物经0.05～0.08mol/L Tris-Hcl缓冲液冲洗2～3次，后冻干备用；

所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS磷酸盐缓冲液进行一定倍数的梯度稀释得融合蛋白稀释液，要求融合蛋白稀释液每10微升中有107个荧光单位。

3.根据权利要求2所述的一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因。

4.根据权利要求2所述的一种乳腺癌自身免疫抗体检测试剂盒，其特征在于，细胞转染实验的方法为磷酸钙转染方法。