[发明专利]一种鉴定鮈亚科鱼类的方法

说明书

本发明公开了一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，利用从NCBI下载的已发表鮈亚科线粒体COI序列，比对并设计鮈亚科鱼类的特异性COI引物并合成；用特异性引物对常见的鮈亚科鱼类DNA样本分别进行扩增；根据PCR产物确认得到目的长度电泳条带，条带经纯化回收测序，之后对测序结果进行BLAST比对分析，确认获得鮈亚科鱼类的COI序列；依据产物的测序结果和已发表相近物种和同种序列比对，并构建邻接法系统发育关系树，同时通过MEGA软件估算已知物种和欲鉴定物种之间的遗传距离，同时结合形态特征进一步确认分子鉴定结果的可靠性。本发明公开的鉴定鮈亚科鱼类的方法，具有检测速度快，识别精确度高，通量高，人为影响小等优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种鉴定鮈亚科鱼类的方法。

背景技术

鱼类是人类的伙伴，为人类提供了许多人体所必须的元素和物质，也是人类食物来源之一，因而保护鱼类的多样性，变得越来越重要。

鮈亚科鱼类生活在江河小支流和池塘等小水体中，栖息条件为静水或微流水环境的浅水地带，喜栖息于水体的中、下层，主要分布于各水系，生殖期为5月，主要摄食水生昆虫，其次为藻类和水生高等植物。但部分种分布区窄，为分布地特有种，其数量甚稀少，为临近濒危的偶见种类。

目前，鱼类鉴别的主要方法仍然是传统的形态分类方法，根据鱼体的形态特征，对鱼的种类进行鉴定，但在不同来源的动物志及鱼类志中缺乏统一的鉴定特征或者是鉴别征存在中间类型而难于区分。且该种方法需要大量的工作经验，同时也需要丰富的专业知识，对于鱼体的完整性要求也比较高。对于一些体型较小的鱼类或者身体被破坏的鱼类，可能无法进行鉴定。因此，提供一种鉴定鮈亚科鱼类的分子生物学方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鉴定鮈亚科鱼类的特异性引物和方法，该方法具有检测速度快，识别精确度高，通量高，人为影响小等优点，可用于鮈亚科鱼类的分子鉴定。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鉴定鮈亚科鱼类的引物，所述引物序列为：

F：5’-TACCTGTGGCA ATTACRCGCTGAT-3’；SEQ ID NO：1；

R：5’-TAAGARTAAAATGGTCCYAAACC-3’；SEQ ID NO：2；

序列中根据国际生物化学联合会(IUB)规定兼并密码子:R＝A/G；Y＝C/T；R代表A或者G；Y代表C或者T；

F为上游引物序列，R为下游引物序列，F与R形成引物对，用于鮈亚科鱼类的鉴定。

进一步，一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，具体步骤如下：

(1)确定鮈亚科鱼类的特异性引物：

①从NCBI数据库下载部分鮈亚科不同种鱼类的线粒体COI基因序列，通过不同种鮈亚科鱼类的COI序列比对，选取不同序列之间的保守片段；

②根据步骤①选取的保守片段，设计并筛选出鮈亚科鱼类的特异性引物；

③利用步骤②获取的特异性引物，对鮈亚科鱼类及其他鱼类的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

④将步骤③获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，鮈亚科鱼类能够扩增出条带，其他鱼类不能扩增出条带；回收条带，进行测序；

⑤将步骤④测序所得峰图文件用LASERGENE软件包中Seqman软件组装为一个contig文件，用NCBI中的BLAST软件进行比对，下载相似度高及其近源种序列，用MEGA 7.0构建系统发育树，计算遗传距离，当序列间遗传距离小于0.02时，初步确定该序列为鮈亚科鱼类序列，从而确定鮈亚科鱼类的特异性引物；