[发明专利]一种牛支原体的nfo-RPA检测方法及检测试剂盒有效
| 申请号： | 201811514580.0 | 申请日： | 2018-12-12 |
| 公开（公告）号： | CN109680080B | 公开（公告）日： | 2023-01-03 |
| 发明（设计）人： | 储岳峰;翟肖辉;郝华芳;陈胜利;颜新敏;刘永生 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/35 |
| 代理公司： | 深圳峰诚志合知识产权代理有限公司 44525 | 代理人： | 陈婷 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种牛 支原体 nfo rpa 检测 方法 试剂盒 | ||
1.一种牛支原体的nfo-RPA检测方法，所述检测方法用于非疾病诊断目的应用，通过nfo-RPA法检测牛支原体，其特征在于，该方法以牛支原体的P80基因序列为模板，设计扩增引物M.b-specific-Forward和M.b-specific-Reverse从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b-specific-Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示；
所述扩增引物M.b-specific-Forward为：
5’-CAAAAACAATAAGTCAGTTAAAGCTCTTTCAG-3’，
扩增引物M.b-specific-Reverse为：
5’-Biotin-CTAACATCAGTACCTTTAAGTGTGAAAATAAC-3’；
其中，Biotin为生物素；
所述探针M.b-specific-Probe为：
5’-FAM-TTACAACAAATTCAAAGAATCTCTAGCTACTA(THF)ATCTCTTACATTACTAG-SpC-3’；
其中，FAM为荧光报告基团，SpC为荧光淬灭基团，THF为四氢呋喃；
所述nfo-RPA反应体系具体为：反应体系为50μL，其中，Rehydration buffer 29.5uL，M.b-specific-Forward 10uM 1.2uL，M.b-specific-Reverse 10uM 1.2uL，M.b-specific-Probe 10uM 0.6uL，Nuclease-free water 10uL，Template 5uL，280mM MgAc 2.5uL。
2.如权利要求1所述的牛支原体的nfo-RPA检测方法，其特征在于，所述nfo-RPA法具体包括以下步骤：
(1)以牛支原体的P80基因为模板设计引物，通过扩增得到包含R1序列的M.b序列；
(2)切胶回收纯化后连接到pMD18-T载体上，然后将连接产物导入到DH-5α感受态细胞，筛选出阳性克隆子；
(3)建立nfo-RPA反应体系，该体系中包括探针，往该nfo-RPA反应体系分别加入牛支原体和其它基因组DNA为模板，检测阳性结果。
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