[发明专利]一种高效重组痘苗病毒载体及其建立方法

说明书

本发明建立了一种高效重组痘苗病毒载体的系统，包括高效重组痘苗病毒载体及其建立方法。本发明利用CRISPR‑Cas9技术敲除痘苗病毒天坛株TK区，然后转染带有EGFP的重组质粒pJ2R‑EGFP。通过荧光筛选，获得缺失TK并插入EGFP的重组病毒，建立一种高效重组痘苗病毒载体的系统。通过分子克隆技术、Western Blot实验、免疫荧光、病毒噬斑形成试验，发现在第一轮重组病毒筛选过程中重组率比传统同源重组方法有所提高。进一步利用PCR技术、琼脂糖凝胶电泳、测序验证得到的重组病毒准确在特定位点被改造。本发明将痘苗病毒载体的重组率提高，为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供应用价值。

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种高效重组痘苗病毒载体及其建立方法。

背景技术

痘病毒(Poxvirus)是病毒粒最大的一类DNA病毒，包括多种类型：痘苗病毒(Vaccinia virus)、天花病毒(Variola virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)和猴痘病毒(Monkey poxvirus)等。其中痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain，VTT)在消灭天花的过程中发挥重大作用。痘苗病毒具有宿主范围广、非必需基因多、高度保守性、外源基因的容量大、胞质复制等特点。

目前，肿瘤的治疗还是一个世界性难题，主要的方法有放化疗、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)以及单克隆抗体疗法。而溶瘤病毒作为肿瘤治疗新的研究方向，目前已经取得了一些研究成果。以腺病毒(Adenovirus)为载体的溶瘤病毒在转移性非小细胞肺癌和三阴乳腺癌(Metastatic NSCLCTNBCJX-594)及脑癌(Brain cancer)中已经进入了临床II期阶段。同时以HSV为载体的Talimogene laherparepvec(T-VEC)治疗黑色素瘤的研究已进入III期阶段。而在痘病毒中，JX-594作为第一个进入临床阶段用于肿瘤治疗的重组病毒，是在痘苗病毒株WesternReserve的基础上将TK区进行敲除，然后插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor,GM-CSF)，在肝癌(Hepatocellelar carcinoma)治疗中已经进入临床III期，可以和Sorafenib等多种化学治疗药物联合使用抵抗肝癌。另一株重组病毒GL-ONC1(GLV-1h68)是以痘苗病毒Lister株为载体，缺失TK、F4L14.5L、A56R，插入Renilla luciferase-GFP、LacZ、gusA基因，在腹膜癌(peritoneal carcinomatosis)治疗中进入临床II期。痘苗病毒天坛株VTT在我国拥有自主知识产权，以VTT作为载体，建立高效获得重组病毒的系统在肿瘤治疗中具有较大应用价值。

同源重组是实现病毒基因组编辑的传统方法，但是其步骤繁琐、过程复杂、周期较长、效率极低，外源插入基因不稳定且不能进行多个病毒蛋白的敲除，阻碍了痘苗病毒载体的发展。因此，获得痘苗病毒的高效重组系统对疫苗载体和溶瘤病毒的研究与开发中起到关键作用。2013年，出现了一项全新的基因编辑技术CRISPR-Cas9，通过RNA引导对基因进行编辑的细菌适应性免疫系统。II型CRISPR-Cas系统能够对真核生物进行基因编辑，主要包括Cas9、crRNA和trans-activating crRNA(tracrRNA)三个元件。gRNA引导Cas9蛋白到达靶序列，形成Cas9/tracrRNA/crRNA复合物，然后切割，切割后的基因组通过转染的重组质粒进行同源重组(homology-directed repair)或非同源末端连接(nonhomologous endjoining)。其中，II型CRISPR-Cas9系统来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，已成功用于哺乳动物细胞的编辑。通过CRISPR-Cas9技术建立高效重组病毒载体的系统，较大程度的提高了重组效率，提高了应用价值。